LncRNA-UCA1在下咽鱗狀細(xì)胞癌中的表達(dá)及對(duì)細(xì)胞功能的影響.pdf

1、下咽鱗狀細(xì)胞癌(Hypopharyngeal squamous cell carcinoma，HSCC)是起源于上消化呼吸道粘膜上皮的惡性腫瘤，其發(fā)病率約占頭頸部惡性腫瘤1.4～5％，占全身惡性腫瘤的0.5％。下咽鱗癌發(fā)生于下咽部的梨狀窩區(qū)，環(huán)后區(qū)及下咽后壁區(qū)，其中發(fā)生于梨狀窩區(qū)最常見(jiàn)，發(fā)生率約為70～80％，下咽后壁區(qū)約為5～22％。在全部下咽腫瘤的病理類(lèi)型中，鱗狀細(xì)胞癌約占90％，其次為腺癌，腺鱗癌，肉瘤等。下咽鱗癌患者的早期臨床表

2、現(xiàn)并不顯著，僅表現(xiàn)為咽部不適或咽部異物感。隨著腫瘤的浸潤(rùn)性生長(zhǎng)，腫瘤發(fā)生破潰，患者可出現(xiàn)咽部疼痛。若腫瘤侵及喉部或聲門(mén)旁間隙，患者可出現(xiàn)聲音嘶啞、呼吸困難，而食道受累則會(huì)出現(xiàn)吞咽困難。下咽鱗癌患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率非常高，部分患者以頸部淋巴結(jié)腫大為首發(fā)癥狀，咽部癥狀可不明顯。早期下咽鱗癌(StageⅠ-Ⅱ)的5年生存率可高達(dá)70％，但由于其癥狀的不典型性及發(fā)病部位的隱匿性，極少的患者能在早期被發(fā)現(xiàn)。約70-85％的患者就診時(shí)，腫瘤已發(fā)展為中晚

3、期(StageⅢ-Ⅳ)，患者5年生存率僅為15-45％。下咽鱗癌的治療包括以手術(shù)為主輔助以術(shù)前或術(shù)后放化療或以放療為主的綜合性治療方案。雖然近年來(lái)下咽鱗癌的治療方法不斷進(jìn)步，下咽鱗癌患者的預(yù)后仍遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能令人滿意。因此，進(jìn)一步探索、發(fā)現(xiàn)下咽鱗癌高敏感性和特異性的腫瘤標(biāo)記物，并尋找新的治療靶點(diǎn)已成為一項(xiàng)十分迫切的任務(wù)。
　　經(jīng)典的分子生物學(xué)理論指出遺傳信息通過(guò)基因編碼的形式進(jìn)行傳遞，RNA僅在DNA序列和編碼蛋白質(zhì)之間起媒介物的作用。

4、隨著分子生物學(xué)理論和人類(lèi)基因組計(jì)劃的發(fā)展，人們認(rèn)識(shí)到，在人類(lèi)基因組中僅有1.5％的基因?yàn)榈鞍踪|(zhì)編碼基因，而90％以上的基因轉(zhuǎn)錄為不具有蛋白質(zhì)編碼功能的非編碼RNA(noncoding RNAs)。長(zhǎng)鏈非編碼RNA是長(zhǎng)度大于200個(gè)核苷酸，缺少有意義的開(kāi)放閱讀框而不具有蛋白質(zhì)編碼功能的RNA，約占全部非編碼RNA的80％。
　　通過(guò)調(diào)控基因表達(dá)等途徑，LncRNA廣泛參與了細(xì)胞生命活動(dòng)的眾多過(guò)程，如細(xì)胞的增值，分化以及染色體的失活等

5、。迄今為止，多個(gè)LncRNA已被證實(shí)能夠在轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)錄后水平以及通過(guò)表觀遺傳學(xué)機(jī)制，調(diào)控基因的表達(dá)，這其中包括:染色體的修飾，維持mRNA穩(wěn)定性及阻礙miRNA對(duì)mRNA的降解等。在腫瘤研究領(lǐng)域，LncRNA也顯示了重要的調(diào)節(jié)功能。研究發(fā)現(xiàn)，LncRNA可以調(diào)控腫瘤細(xì)胞的凋亡、增殖、細(xì)胞周期以及轉(zhuǎn)移等生物學(xué)行為。并且，研究者在越來(lái)越多的腫瘤中發(fā)現(xiàn)了LncRNA的重要調(diào)節(jié)功能，其中包括:乳腺癌，肺癌，胰腺癌，骨肉瘤，肝細(xì)胞肝癌，白血病等。L

6、ncRNA在一系列的惡性腫瘤中異常表達(dá)，問(wèn)接說(shuō)明了其同時(shí)具有促進(jìn)腫瘤形成和腫瘤抑制雙重角色。
　　目前，大多數(shù)癌癥的生物標(biāo)記物都是蛋白質(zhì)編碼基因，蛋白質(zhì)編碼基兇的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物或蛋白質(zhì)本身。而近年來(lái)，非編碼RNA卻成為了該領(lǐng)域的一大熱點(diǎn)，多種LncRNA被證實(shí)可以作為全新的腫痛標(biāo)志物以及潛在的治療靶點(diǎn)。尿路上皮癌胚抗原1(Urothelial carcinoma-associated1，UCA1)就是一種具有顯著特征的LncRNA。Ln

7、cRNA-UCA1最初被發(fā)現(xiàn)在膀胱移行細(xì)胞癌中高表達(dá)，屬于人內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒H家族，cDNA全長(zhǎng)1439bp。進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)LncRNA-UCA1有明顯的促進(jìn)膀胱癌形成并增強(qiáng)其侵襲能力的作用。此外，LncRNA-UCA1在其他惡性腫瘤中也呈現(xiàn)出差異性表達(dá)，表現(xiàn)為與癌旁組織相比，在癌組織中不同程度的高表達(dá)，并促進(jìn)腫瘤的形成。更多的研究表明，LncRNA-UCA1在多個(gè)腫瘤同樣起到了癌基因的作用。比如，Zuo等發(fā)現(xiàn)TGF-β1可誘導(dǎo)Lnc

8、RNA-UCA1表達(dá)上調(diào)促進(jìn)胃癌的侵襲和轉(zhuǎn)移。Zhou等發(fā)現(xiàn)LncRNA-UCA1在前列腺癌組織中表達(dá)上調(diào)且與患者的預(yù)后不良相關(guān)。Zhao等發(fā)現(xiàn)LncRNA-UCA1能夠促進(jìn)神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖并能夠通過(guò)其表達(dá)水平對(duì)患者的預(yù)后進(jìn)行預(yù)測(cè)。Xiao等發(fā)現(xiàn)LncRNA-UCA1能夠通過(guò)miR-203調(diào)控Snai12基因的表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)肝細(xì)胞肝癌的進(jìn)展。根據(jù)這些研究，我們提出疑問(wèn)LncRNA-UCA1是否可以用來(lái)作為下咽鱗狀細(xì)胞癌的診斷指標(biāo)、或

9、評(píng)價(jià)其預(yù)后呢？另外，LncRNA-UCA1會(huì)通過(guò)哪些途徑來(lái)影響下咽鱗狀細(xì)胞癌的生物學(xué)行為呢？
　　為此，我們首先對(duì)下咽鱗癌及癌旁組織進(jìn)行了高通量LncRNA芯片篩查。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，眾多LncRNA在下咽鱗癌組織中相對(duì)癌旁組織顯著高表達(dá)，其中也包括LncRNA-UCA1。根據(jù)此結(jié)果，我們推測(cè)LncRNA-UCA1在下咽鱗癌中也可能作為癌基因?qū)δ[瘤的發(fā)生發(fā)展起促進(jìn)作用。
　　本課題進(jìn)行了以下2個(gè)部分的研究，(1)采用qRT-PC

10、R的方法檢測(cè)53例下咽鱗癌及對(duì)應(yīng)癌旁組織標(biāo)本中LncRNA-UCA1的相對(duì)表達(dá)量，分析其與下咽鱗癌患者臨床病理特征的相關(guān)性，并且評(píng)價(jià)LncRNA-UCA1的表達(dá)量與下咽鱗癌患者預(yù)后的關(guān)系(2)構(gòu)建干擾LncRNA-UCA1表達(dá)的慢病毒載體，并通過(guò)細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)，細(xì)胞周期檢測(cè)實(shí)驗(yàn)，細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn)，細(xì)胞transwell實(shí)驗(yàn)等進(jìn)一步研究LncRNA-UCA1對(duì)下咽鱗癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響。
　　第一部分 LncRNA-UCA1在下咽鱗

11、癌中的表達(dá)及臨床意義
　　研究目的：
　　檢測(cè)下咽鱗癌患者腫瘤組織及癌旁組織中LncRNA-UCA1的相對(duì)表達(dá)量，并進(jìn)一步分析LncRNA-UCA1的表達(dá)與下咽鱗癌患者臨床病理特征及預(yù)后的關(guān)系。
　　研究方法：
　　收集山東大學(xué)齊魯醫(yī)院耳鼻咽喉科2011年3月至2011年12月行下咽鱗癌切除患者的腫瘤組織及相對(duì)應(yīng)的癌旁組織共53對(duì)，采用qRT-PCR(quantitative real-time PCR)的方法，

12、檢測(cè)LncRNA-UCA1在下咽鱗癌及癌旁組織中的相對(duì)表達(dá)量，并統(tǒng)計(jì)患者的臨床病理特征及預(yù)后。LncRNA-UCA1的表達(dá)量與臨床病理特征的關(guān)系用Chi-square或Fisher精確檢驗(yàn)評(píng)估。T檢驗(yàn)用于比較兩個(gè)實(shí)驗(yàn)組數(shù)據(jù)之間的差異。Kaplan-Meier法用于繪制LncRNA-UCA1高表達(dá)或低表達(dá)患者的生存曲線。Log-rank法用于比較患者的總體生存率。
　　研究結(jié)果：
　　LncRNA-UCA1在下咽鱗癌組織中的相

13、對(duì)表達(dá)量為(0.0088±0.0050)，明顯高于LncRNA-UCA1在癌旁組織中的表達(dá)量(0.0051±0.0040，P＜0.05)。高表達(dá)的LncRNA-UCA1與更差的T分級(jí)(P=0.034)，更晚的臨床分期(P=0.021)及陽(yáng)性淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（P=0.02）均顯著相關(guān)。而LncRNA-UCA1的表達(dá)與其他臨床病理特征未發(fā)現(xiàn)有顯著的相關(guān)性，如忠者的年齡(P=0.213)，腫瘤的分化程度(P=0.613)。另外，我們還發(fā)現(xiàn)，以Lnc

14、RNA-UCA1相對(duì)表達(dá)量的巾位數(shù)為界，將患者分為L(zhǎng)ncRNA-UCA1高表達(dá)組和低表達(dá)組。LncRNA-UCA1高表達(dá)組的總體生存率要明顯低于低表達(dá)組(P＜0.0001)。
　　研究結(jié)論：
　　LncRNA-UCA1在下咽鱗癌中呈高表達(dá)狀態(tài)且LncRNA-UCA1的表達(dá)水平與下咽鱗癌的T分級(jí)、臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，以及患者總體生存率均明顯相關(guān)。而與患者的年齡，腫瘤的分化程度無(wú)明顯相關(guān)性。由此說(shuō)明，LncRNA-UCA1可能

15、促進(jìn)了下咽鱗癌的發(fā)生發(fā)展并且可以做一個(gè)評(píng)價(jià)下咽鱗癌患者預(yù)后的生物學(xué)指標(biāo)。
　　第二部分 LncRNA-UCA1對(duì)下咽鱗癌細(xì)胞功能的影響
　　研究目的：
　　研究LncRNA-UCA1對(duì)下咽鱗癌絀胞凋亡，增殖，侵襲及遷徙等細(xì)胞功能的影響
　　研究方法：
　　構(gòu)建LncRNA-UCA1低表達(dá)慢病毒載體，并將病毒感染人咽鱗癌細(xì)胞株FaDu細(xì)胞，qRT-PCR法檢測(cè)LncRNA-UCA1在FaDu細(xì)胞中的表達(dá)并評(píng)估

16、干擾效率。細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)，細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn)及細(xì)胞周期實(shí)驗(yàn)檢測(cè)LncRNA-UCA1
　　對(duì)FaDu細(xì)胞增殖能力的影響，transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)LncRNA-UCA1對(duì)FaDu細(xì)胞侵襲及遷移能力的影響。
　　研究結(jié)果：
　　qRT-PCR法檢測(cè)結(jié)果顯示干擾UCA1轉(zhuǎn)染FaDu (Sh1 and Sh2)組細(xì)胞的LncRNA-UCA1的表達(dá)水平明顯低于Control組細(xì)胞(P＜0.05)。流式細(xì)胞儀檢測(cè)LncRNA-UCA

17、1對(duì)FaDu細(xì)胞凋亡的影響。結(jié)果示，轉(zhuǎn)染5天后，低表達(dá)LncRNA-UCA1 FaDu細(xì)胞的凋亡比例較對(duì)照組明顯增高（P＜0.05）。流式細(xì)胞儀檢測(cè)LncRNA-UCA1對(duì)FaDu細(xì)胞周期的影響，結(jié)果示，相比于對(duì)照組，降低LncRNA-UCA1的表達(dá)能夠明顯的誘導(dǎo)FaDu細(xì)胞聚集于G0/G1期，減少S期的細(xì)胞聚集（P＜0.05）。細(xì)胞克隆實(shí)驗(yàn)檢測(cè)LncRNA-UCA1對(duì)FaDu細(xì)胞的增殖能力的影響。結(jié)果顯示:低表達(dá)LncRNA-UCA1