STK33基因在下咽鱗狀細(xì)胞癌發(fā)生發(fā)展中的作用機(jī)制研究.pdf

1、目的:
　　下咽癌是頭頸部常見(jiàn)惡性腫瘤之一，尚缺乏有效的治療手段。STK33是一個(gè)非常有潛力的進(jìn)行有效分子治療的基因，但是其在惡性腫瘤中的相關(guān)生物功能和分子機(jī)制尚不清楚。本課題擬借助RNAi技術(shù)明確STK33對(duì)下咽癌細(xì)胞株Fadu細(xì)胞生物學(xué)行為增殖與凋亡、細(xì)胞周期、腫瘤細(xì)胞克隆集落能力、侵襲和轉(zhuǎn)移、以及上皮細(xì)胞間葉轉(zhuǎn)化的影響，并通過(guò)分子生物學(xué)技術(shù)了解其中可能存在的分子機(jī)制以及ERK1/2信號(hào)通路在其中可能存在的調(diào)節(jié)作用。
　

2、　方法:
　　1.Fadu細(xì)胞中STK33的表達(dá)及STK33-RNAi慢病毒的構(gòu)建與轉(zhuǎn)染
　　1)通過(guò)IHC方法檢測(cè)30例人下咽癌組織與配對(duì)的正常粘膜組織中STK33的蛋白質(zhì)表達(dá)情況。
　　2)構(gòu)建STK33-RNAi和對(duì)照慢病毒載體，并進(jìn)行RNAi慢病毒包裝和滴度檢測(cè)。
　　3)將STK33-RNAi和對(duì)照慢病毒轉(zhuǎn)染入Fadu細(xì)胞中，并進(jìn)行轉(zhuǎn)染效率測(cè)定。
　　4)Western blot方法檢測(cè)轉(zhuǎn)染慢病毒

3、后Fadu細(xì)胞中STK33蛋白表達(dá)的變化。
　　2.STK33-RNAi和PD98059對(duì)Fadu細(xì)胞增殖與凋亡的影響
　　1)Fadu細(xì)胞復(fù)蘇、傳代培養(yǎng)，按照Mock、5μMPD98059、STK33-RNAi、STK33-RNAi&5μMPD98059進(jìn)行分組。
　　2)MTT實(shí)驗(yàn)首先確定PD98059對(duì)Fadu細(xì)胞作用的最佳濃度和時(shí)間，在此基礎(chǔ)上了解STK33-RNAi和PD98059對(duì)Fadu細(xì)胞活性的影響。<

4、br>　　3)Hoechst.33342&PI雙染實(shí)驗(yàn)了解STK33-RNAi和5μMPD98059對(duì)Fadu細(xì)胞凋亡的影響。
　　4)流式細(xì)胞術(shù)細(xì)胞周期實(shí)驗(yàn)了解STK33-RNAi和5μMPD98059對(duì)Fadu細(xì)胞細(xì)胞周期的影響。
　　5)腫瘤細(xì)胞克隆集落形成實(shí)驗(yàn)了解STK33-RNAi和5μMPD98059對(duì)Fadu細(xì)胞克隆集落形成能力的影響。
　　6)通過(guò)Real-time PCR和Western blot實(shí)驗(yàn)

5、了解STK33和ERK1/2之間可能存在的關(guān)系。
　　7)通過(guò)Real-time PCR了解STK33-RNAi和5μMPD98059對(duì)Fadu細(xì)胞增殖與凋亡相關(guān)基因Caspase-3、Bcl-2、Ki-67在mRNA水平的影響。
　　8)通過(guò)Western blot實(shí)驗(yàn)從蛋白水平了解STK33-RNAi和5μMPD98059對(duì)Fadu細(xì)胞增殖與凋亡相關(guān)基因Caspase-3、Bcl-2、Ki-67的影響。
　　3.S

6、TK33-RNAi和5μMPD98059對(duì)Fadu細(xì)胞侵襲、轉(zhuǎn)移以及上皮間葉轉(zhuǎn)化的影響
　　1)IHC方法檢測(cè)STK33在人下咽癌組織不同分化程度、腫瘤大小、臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與否中的表達(dá)情況
　　2)Fadu細(xì)胞復(fù)蘇、傳代培養(yǎng)，按照Mock、5μMPD98059、STK33-RNAi、STK33-RNAi&5μM PD98059進(jìn)行分組。
　　3)腫瘤細(xì)胞侵襲與轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)了解STK33-RNAi和5μMPD98059

7、對(duì)Fadu細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移行為的影響。
　　4)通過(guò)Real-time PCR了解STK33-RNAi和5μMPD98059對(duì)Fadu細(xì)胞上皮細(xì)胞間葉轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)移相關(guān)基因E-cadherin、Vimentin、Nm-23在mRNA水平的影響。
　　5)通過(guò)Western blot實(shí)驗(yàn)從蛋白水平了解STK33-RNAi和5μMPD98059對(duì)Fadu細(xì)胞上皮細(xì)胞間葉轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)移相關(guān)基因E-cadherin、Vimentin、Nm-2

8、3的影響。
　　4.統(tǒng)計(jì)學(xué)處理
　　應(yīng)用SPASS18.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析處理。計(jì)量資料用Mean±SD或Mean±SE表示，應(yīng)用one-way ANOVA分析進(jìn)行數(shù)據(jù)的組間比較，以P＜0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果:
　　1.STK33在人下咽癌組織中的表達(dá)及STK33-RNAi慢病毒的構(gòu)建與轉(zhuǎn)染入Fadu細(xì)胞
　　1)IHC結(jié)果表明配對(duì)的人原位下咽癌組織（11.63±3.56）、浸

9、潤(rùn)性下咽癌組織（13.97±3.47）與正常粘膜鱗狀上皮細(xì)胞（4.17±3.38）中STK33的蛋白質(zhì)表達(dá)均有顯著性差異(P＜0.05)，而且STK33在原位癌和浸潤(rùn)性癌之間的表達(dá)也有明顯差異(P＜0.05)。
　　2)成功構(gòu)建STK33-RNAi和對(duì)照慢病毒載體，并將其成功轉(zhuǎn)染入Fadu細(xì)胞內(nèi)。
　　3)與對(duì)照組相比較，STK33-RNAi能顯著性降低STK33在Fadu細(xì)胞內(nèi)的蛋白表達(dá)水平。
　　2.STK33-R

10、NAi和PD98059對(duì)Fadu細(xì)胞增殖與凋亡的影響
　　1)通過(guò)MTT實(shí)驗(yàn)確定5μMPD98059作用Fadu細(xì)胞48h是PD98059對(duì)Fadu細(xì)胞作用的最佳濃度和時(shí)間的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)表明與對(duì)照組相比較，STK33-RNAi和5μMPD98059不僅能分別顯著性降低Fadu細(xì)胞活性，而且二者在此作用上具有協(xié)同效應(yīng)。
　　2)Hoechst.33342&PI雙染實(shí)驗(yàn)檢測(cè)表明與對(duì)照組相比較，STK33-RNAi和5μM

11、PD9809均分別導(dǎo)致Fadu細(xì)胞凋亡，并能協(xié)同導(dǎo)致Fadu細(xì)胞凋亡。
　　3)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期結(jié)果顯示與對(duì)照組相比較，STK33-RNAi對(duì)Fadu細(xì)胞的G2/M期具有阻滯作用，5μMPD98059阻滯Fadu細(xì)胞的G0/G1期。
　　4)腫瘤細(xì)胞克隆集落形成實(shí)驗(yàn)中，與對(duì)照組相比較，STK33-RNAi和5μMPD98059具有分別以及協(xié)同降低Fadu細(xì)胞克隆集落形成的能力。
　　5)Real-time PCR

12、和Western blot實(shí)驗(yàn)一致性表明，在Fadu細(xì)胞中，與對(duì)照組相比較，5μMPD98059能明顯降低STK33的表達(dá)，而ERK1/2的表達(dá)在對(duì)照組和STK33-RNAi組中沒(méi)有顯著性差異。
　　6)Real-time PCR和Western blot實(shí)驗(yàn)一致性顯示，在Fadu細(xì)胞中，與對(duì)照組比較，STK33-RNAi和5μMPD98059均能夠單獨(dú)以及協(xié)同性顯著地降低Bcl-2表達(dá)的同時(shí)明顯增加Ki-67的表達(dá);另外，STK

13、33-RNAi能夠明顯增加Caspase-3的表達(dá)，而5μMPD98059對(duì)Caspase-3的作用與對(duì)照組比較則沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　3.STK33-RNAi和PD98059對(duì)Fadu細(xì)胞侵襲、轉(zhuǎn)移以及上皮間葉轉(zhuǎn)化的影響
　　1)免疫組化結(jié)果顯示STK33表達(dá)在非角化型鱗癌中顯著性高于角化型鱗癌，在腫瘤＞2cm中明顯高于腫瘤＜2cm;而且，STK33的IHC得分隨著臨床分期的增高、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移都明顯增加。
　　2)腫瘤

14、細(xì)胞侵襲與轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與對(duì)照組比較，STK33-RNAi和5μMPD98059均能夠單獨(dú)以及協(xié)同性顯著地降低Fadu細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力。
　　3)Real-time PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在Fadu細(xì)胞中，與對(duì)照組相比較，STK33-RNAi和5μMPD98059具有分別以及協(xié)同性顯著地增加Nm-23和E-cadherin的mRNA表達(dá)水平;另外，STK33-RNAi和5μMPD98059能分別明顯降低Vimentin的mR

15、NA表達(dá)水平。
　　4)Western blot檢測(cè)表明，在Fadu細(xì)胞中，與對(duì)照組相比較，STK33-RNAi和5μMPD98059具有分別以及協(xié)同性顯著地增加Nm-23和E-cadherin的蛋白質(zhì)表達(dá)水平;另外，STK33-RNAi和5μMPD98059能分別明顯降低Vimentin的蛋白質(zhì)表達(dá)水平。
　　結(jié)論:
　　1.我們的研究首次證明STK33在人下咽癌組織中明確表達(dá)，并且可能在下咽癌的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中具有

16、重要促進(jìn)作用。
　　2.STK33-RNAi能顯著性降低Fadu細(xì)胞的活性，可能通過(guò)增加Caspase-3的表達(dá)和降低Bcl-2的表達(dá)導(dǎo)致細(xì)胞凋亡;另外，可能通過(guò)下調(diào)Ki-67的表達(dá)與Fadu細(xì)胞阻滯于G2/M期有關(guān)，同時(shí)與下調(diào)Fadu細(xì)胞克隆集落形成能力有關(guān)。STK33可能是ERK1/2信號(hào)通路的下游因子，STK33促進(jìn)Fadu細(xì)胞增殖和克隆集落形成能力、影響細(xì)胞周期以及抑制細(xì)胞凋亡可能是通過(guò)ERK1/2信號(hào)通路的作用影響下咽癌

17、的演進(jìn)，此結(jié)果為STK33做為下咽癌分子靶向治療的潛在因子提供了基礎(chǔ)理論依據(jù)。
　　3.STK33高表達(dá)與人下咽癌組織的分化差、轉(zhuǎn)移、臨床分期增高相關(guān)。STK33可能通過(guò)參與ERK1/2信號(hào)通路而協(xié)同性抑制E-cadherin的作用，另外通過(guò)誘導(dǎo)Vimentin的作用促進(jìn)EMT的發(fā)生，同時(shí)可能通過(guò)ERK1/2信號(hào)通路下調(diào)腫瘤轉(zhuǎn)移抑制基因Nm-23的作用，進(jìn)而增加Fadu細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力促使下咽癌的進(jìn)展更為迅速，此結(jié)果為STK3