STK33基因在下咽鱗狀細胞癌發(fā)生發(fā)展中的作用機制研究.pdf

1、目的:
　　下咽癌是頭頸部常見惡性腫瘤之一，尚缺乏有效的治療手段。STK33是一個非常有潛力的進行有效分子治療的基因，但是其在惡性腫瘤中的相關生物功能和分子機制尚不清楚。本課題擬借助RNAi技術明確STK33對下咽癌細胞株Fadu細胞生物學行為增殖與凋亡、細胞周期、腫瘤細胞克隆集落能力、侵襲和轉(zhuǎn)移、以及上皮細胞間葉轉(zhuǎn)化的影響，并通過分子生物學技術了解其中可能存在的分子機制以及ERK1/2信號通路在其中可能存在的調(diào)節(jié)作用。
　

2、　方法:
　　1.Fadu細胞中STK33的表達及STK33-RNAi慢病毒的構(gòu)建與轉(zhuǎn)染
　　1)通過IHC方法檢測30例人下咽癌組織與配對的正常粘膜組織中STK33的蛋白質(zhì)表達情況。
　　2)構(gòu)建STK33-RNAi和對照慢病毒載體，并進行RNAi慢病毒包裝和滴度檢測。
　　3)將STK33-RNAi和對照慢病毒轉(zhuǎn)染入Fadu細胞中，并進行轉(zhuǎn)染效率測定。
　　4)Western blot方法檢測轉(zhuǎn)染慢病毒

3、后Fadu細胞中STK33蛋白表達的變化。
　　2.STK33-RNAi和PD98059對Fadu細胞增殖與凋亡的影響
　　1)Fadu細胞復蘇、傳代培養(yǎng)，按照Mock、5μMPD98059、STK33-RNAi、STK33-RNAi&5μMPD98059進行分組。
　　2)MTT實驗首先確定PD98059對Fadu細胞作用的最佳濃度和時間，在此基礎上了解STK33-RNAi和PD98059對Fadu細胞活性的影響。<

4、br>　　3)Hoechst.33342&PI雙染實驗了解STK33-RNAi和5μMPD98059對Fadu細胞凋亡的影響。
　　4)流式細胞術細胞周期實驗了解STK33-RNAi和5μMPD98059對Fadu細胞細胞周期的影響。
　　5)腫瘤細胞克隆集落形成實驗了解STK33-RNAi和5μMPD98059對Fadu細胞克隆集落形成能力的影響。
　　6)通過Real-time PCR和Western blot實驗

5、了解STK33和ERK1/2之間可能存在的關系。
　　7)通過Real-time PCR了解STK33-RNAi和5μMPD98059對Fadu細胞增殖與凋亡相關基因Caspase-3、Bcl-2、Ki-67在mRNA水平的影響。
　　8)通過Western blot實驗從蛋白水平了解STK33-RNAi和5μMPD98059對Fadu細胞增殖與凋亡相關基因Caspase-3、Bcl-2、Ki-67的影響。
　　3.S

6、TK33-RNAi和5μMPD98059對Fadu細胞侵襲、轉(zhuǎn)移以及上皮間葉轉(zhuǎn)化的影響
　　1)IHC方法檢測STK33在人下咽癌組織不同分化程度、腫瘤大小、臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與否中的表達情況
　　2)Fadu細胞復蘇、傳代培養(yǎng)，按照Mock、5μMPD98059、STK33-RNAi、STK33-RNAi&5μM PD98059進行分組。
　　3)腫瘤細胞侵襲與轉(zhuǎn)移實驗了解STK33-RNAi和5μMPD98059

7、對Fadu細胞侵襲和轉(zhuǎn)移行為的影響。
　　4)通過Real-time PCR了解STK33-RNAi和5μMPD98059對Fadu細胞上皮細胞間葉轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)移相關基因E-cadherin、Vimentin、Nm-23在mRNA水平的影響。
　　5)通過Western blot實驗從蛋白水平了解STK33-RNAi和5μMPD98059對Fadu細胞上皮細胞間葉轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)移相關基因E-cadherin、Vimentin、Nm-2

8、3的影響。
　　4.統(tǒng)計學處理
　　應用SPASS18.0統(tǒng)計學軟件進行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計分析處理。計量資料用Mean±SD或Mean±SE表示，應用one-way ANOVA分析進行數(shù)據(jù)的組間比較，以P＜0.05認為差異有統(tǒng)計學意義。
　　結(jié)果:
　　1.STK33在人下咽癌組織中的表達及STK33-RNAi慢病毒的構(gòu)建與轉(zhuǎn)染入Fadu細胞
　　1)IHC結(jié)果表明配對的人原位下咽癌組織（11.63±3.56）、浸

9、潤性下咽癌組織（13.97±3.47）與正常粘膜鱗狀上皮細胞（4.17±3.38）中STK33的蛋白質(zhì)表達均有顯著性差異(P＜0.05)，而且STK33在原位癌和浸潤性癌之間的表達也有明顯差異(P＜0.05)。
　　2)成功構(gòu)建STK33-RNAi和對照慢病毒載體，并將其成功轉(zhuǎn)染入Fadu細胞內(nèi)。
　　3)與對照組相比較，STK33-RNAi能顯著性降低STK33在Fadu細胞內(nèi)的蛋白表達水平。
　　2.STK33-R

10、NAi和PD98059對Fadu細胞增殖與凋亡的影響
　　1)通過MTT實驗確定5μMPD98059作用Fadu細胞48h是PD98059對Fadu細胞作用的最佳濃度和時間的基礎上，進一步的實驗表明與對照組相比較，STK33-RNAi和5μMPD98059不僅能分別顯著性降低Fadu細胞活性，而且二者在此作用上具有協(xié)同效應。
　　2)Hoechst.33342&PI雙染實驗檢測表明與對照組相比較，STK33-RNAi和5μM

11、PD9809均分別導致Fadu細胞凋亡，并能協(xié)同導致Fadu細胞凋亡。
　　3)流式細胞術檢測細胞周期結(jié)果顯示與對照組相比較，STK33-RNAi對Fadu細胞的G2/M期具有阻滯作用，5μMPD98059阻滯Fadu細胞的G0/G1期。
　　4)腫瘤細胞克隆集落形成實驗中，與對照組相比較，STK33-RNAi和5μMPD98059具有分別以及協(xié)同降低Fadu細胞克隆集落形成的能力。
　　5)Real-time PCR

12、和Western blot實驗一致性表明，在Fadu細胞中，與對照組相比較，5μMPD98059能明顯降低STK33的表達，而ERK1/2的表達在對照組和STK33-RNAi組中沒有顯著性差異。
　　6)Real-time PCR和Western blot實驗一致性顯示，在Fadu細胞中，與對照組比較，STK33-RNAi和5μMPD98059均能夠單獨以及協(xié)同性顯著地降低Bcl-2表達的同時明顯增加Ki-67的表達;另外，STK

13、33-RNAi能夠明顯增加Caspase-3的表達，而5μMPD98059對Caspase-3的作用與對照組比較則沒有統(tǒng)計學差異。
　　3.STK33-RNAi和PD98059對Fadu細胞侵襲、轉(zhuǎn)移以及上皮間葉轉(zhuǎn)化的影響
　　1)免疫組化結(jié)果顯示STK33表達在非角化型鱗癌中顯著性高于角化型鱗癌，在腫瘤＞2cm中明顯高于腫瘤＜2cm;而且，STK33的IHC得分隨著臨床分期的增高、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移都明顯增加。
　　2)腫瘤

14、細胞侵襲與轉(zhuǎn)移實驗結(jié)果表明，與對照組比較，STK33-RNAi和5μMPD98059均能夠單獨以及協(xié)同性顯著地降低Fadu細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力。
　　3)Real-time PCR實驗結(jié)果顯示，在Fadu細胞中，與對照組相比較，STK33-RNAi和5μMPD98059具有分別以及協(xié)同性顯著地增加Nm-23和E-cadherin的mRNA表達水平;另外，STK33-RNAi和5μMPD98059能分別明顯降低Vimentin的mR

15、NA表達水平。
　　4)Western blot檢測表明，在Fadu細胞中，與對照組相比較，STK33-RNAi和5μMPD98059具有分別以及協(xié)同性顯著地增加Nm-23和E-cadherin的蛋白質(zhì)表達水平;另外，STK33-RNAi和5μMPD98059能分別明顯降低Vimentin的蛋白質(zhì)表達水平。
　　結(jié)論:
　　1.我們的研究首次證明STK33在人下咽癌組織中明確表達，并且可能在下咽癌的發(fā)生、發(fā)展過程中具有

16、重要促進作用。
　　2.STK33-RNAi能顯著性降低Fadu細胞的活性，可能通過增加Caspase-3的表達和降低Bcl-2的表達導致細胞凋亡;另外，可能通過下調(diào)Ki-67的表達與Fadu細胞阻滯于G2/M期有關，同時與下調(diào)Fadu細胞克隆集落形成能力有關。STK33可能是ERK1/2信號通路的下游因子，STK33促進Fadu細胞增殖和克隆集落形成能力、影響細胞周期以及抑制細胞凋亡可能是通過ERK1/2信號通路的作用影響下咽癌

17、的演進，此結(jié)果為STK33做為下咽癌分子靶向治療的潛在因子提供了基礎理論依據(jù)。
　　3.STK33高表達與人下咽癌組織的分化差、轉(zhuǎn)移、臨床分期增高相關。STK33可能通過參與ERK1/2信號通路而協(xié)同性抑制E-cadherin的作用，另外通過誘導Vimentin的作用促進EMT的發(fā)生，同時可能通過ERK1/2信號通路下調(diào)腫瘤轉(zhuǎn)移抑制基因Nm-23的作用，進而增加Fadu細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力促使下咽癌的進展更為迅速，此結(jié)果為STK3