雙靶向MMP14和Zn2+多肽小分子篩選與分子模擬.pdf

1、惡性腫瘤是一類嚴重危害人類生命和健康的疾病,尋求腫瘤早期診斷和有效預(yù)防治療的方法和藥物一直是生命科學家們追求的目標。在腫瘤相關(guān)的各類重要靶蛋白中,基質(zhì)金屬蛋白酶(Matrix metalloproteinases,MMPs)在腫瘤的發(fā)生和發(fā)展中起著重要的作用。MMP14作為第一個鑒別出的膜型基質(zhì)金屬蛋白酶,它直接或間接降解細胞外基質(zhì)中的多種成分,并對粘附分子有調(diào)節(jié)作用,被認為是MMPs家族中與腫瘤侵襲關(guān)系最密切的酶。
　　 本研

2、究以雌二醇誘導表達MMP14蛋白的MG-63為起始細胞作用靶標,利用商品化噬菌體隨機十二肽庫對其進行細胞消減篩選,通過多輪篩選富集獲得與靶標特異性結(jié)合的多肽,確定一致序列,并對其進行同源序列比對、分子模擬、金屬離子親和層析、體外細胞測定等分析,確定結(jié)合肽對MMP14和金屬離子的雙靶向性。
　　 研究結(jié)果表明,經(jīng)過4-5輪的篩選,噬菌體得到有效富集,共獲得8條新的序列,GenBank Blast未發(fā)現(xiàn)篩選獲得的序列與已知的蛋白或結(jié)

3、構(gòu)域存在任何同源性,即為首次發(fā)現(xiàn)；結(jié)合實驗室前期工作以MMP14蛋白催化結(jié)構(gòu)域和差選方法篩選獲得所有序列,對它們進行多序列比對、主觀分類等顯示可能的一致序列有:AHQ／SLH／P,HHXH,L／I／EPLL／I,MKPSR／MPKSR,K／RAPK／TS,ARXQ；分子模擬與對接進一步確認一致序列能與MMP14催化結(jié)構(gòu)域的氨基酸120-125區(qū)域良好分子對接并具有一定的專一性,與MMP14的HX區(qū)域不能對接成功。由于對接位點正好處于MM

4、P14的Zn離子結(jié)合區(qū)域,所以推斷多條結(jié)合肽不僅靶向MMP14同時結(jié)合金屬離子,隨后的金屬離子親和力測定實驗也佐證了這一推斷。細胞生物學研究確認所測定的含結(jié)合肽噬菌體對MG-63細胞的活力具有很好的抑制作用,并且合成的AHQLH、LPLL、MKPSR、DTARFQ一致序列多肽在μg級水平對MG-63細胞活力具有一定的抑制能力,呈現(xiàn)出明顯的劑量依賴關(guān)系,其中AHQLH在濃度為10μg／ml下對細胞的抑制率即可達到41.6％。在此基礎(chǔ)上加以

5、改進設(shè)計的新型融合肽序列也較原先的抗菌肽序能夠更好地抑制MG-63細胞的活力。為了進一步確認獲得的一致序列對MMP14的靶向性,選取了能夠表達MMP14蛋白的HEPG-2細胞和不能表達MMP14蛋白的Hela和MCF-7細胞分別作了細胞增殖MTT測定,結(jié)果顯示所有合成的多肽一定程度上都能抑制HEPG-2細胞的活力但是對Hela細胞和MCF-7細胞的活力幾乎沒有影響,進一步佐證了我們獲得的一致序列是通過作用于MMP14蛋白而抑制了腫瘤細胞