原發(fā)性肝癌患者外周血循環(huán)腫瘤細(xì)胞的EMT分型及臨床意義.pdf

1、目的：
　　原發(fā)性肝癌是世界上最常見的具有高發(fā)病率和死亡率的惡性腫瘤之一，手術(shù)切除是大多數(shù)原發(fā)性肝癌(primary liver cancer,PLC)的首選治療方式，然而術(shù)后復(fù)發(fā)是影響PLC預(yù)后的主要原因。目前對(duì)于PLC的復(fù)發(fā)監(jiān)測(cè)只要依靠B超、CT及血清AFP，這些傳統(tǒng)監(jiān)測(cè)手段是無(wú)法做到早期診斷復(fù)發(fā)。因此，發(fā)現(xiàn)具有早期診斷PLC復(fù)發(fā)的敏感性生物標(biāo)志物至關(guān)重要。
　　在過去的幾十年中，腫瘤患者外周血中循環(huán)腫瘤細(xì)胞的檢測(cè)已經(jīng)獲

2、得越來(lái)越多的關(guān)注。因?yàn)橥庵苎h(huán)腫瘤細(xì)胞檢測(cè)是一種簡(jiǎn)單、可重復(fù)和微創(chuàng)的操作，其可作為理想的取樣檢測(cè)手段。循環(huán)腫瘤細(xì)胞(circulating tumor cells，CTCs)是指存在于實(shí)體瘤外的腫瘤細(xì)胞。事實(shí)上，源自原發(fā)性腫瘤灶的具有高度侵襲性的腫瘤細(xì)胞不斷增殖，它們?cè)陔x開原發(fā)腫瘤灶并進(jìn)入外周血后成為具有侵襲和轉(zhuǎn)移潛能的循環(huán)腫瘤細(xì)胞。因此，近年來(lái)CTCs在腫瘤診斷，復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移中的作用得到越來(lái)越多的研究。已有研究證實(shí)，上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化是一

3、種細(xì)胞形態(tài)轉(zhuǎn)化過程:細(xì)胞失去其上皮特征并獲得間充質(zhì)性質(zhì)。同時(shí)，間充質(zhì)細(xì)胞可能轉(zhuǎn)化為上皮表型細(xì)胞，從而促使腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移定值。許多研究已經(jīng)建立了上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化和各型CTCs形成之間的聯(lián)系。然而，目前基于CTCs的檢測(cè)技術(shù)有數(shù)十種，其每種檢測(cè)技術(shù)的方法及原理各有不同，因而選取并深入研究肝癌CTCs檢測(cè)技術(shù)對(duì)于實(shí)施本項(xiàng)目起著關(guān)鍵作用。在本研究中，我們首先選取并確立了CanPatrolTM肝癌CTCs檢測(cè)技術(shù)，明確其檢測(cè)技術(shù)的基本方法和原理，研究

4、其檢測(cè)技術(shù)的靈敏度、特異度及可重復(fù)性;在此檢測(cè)技術(shù)的基礎(chǔ)上分析了EMT表型CTCs在PLC和非惡性肝臟疾病(nonmalignant liver diseases，NLD)之間的差異，試圖提高PLC診斷的準(zhǔn)確性。
　　眾所周知，腫瘤復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移是一個(gè)非常復(fù)雜的過程，而其血型轉(zhuǎn)移過程通常需要CTCs從原發(fā)性腫瘤灶進(jìn)入外周血.并且由于外周血CTCs檢測(cè)是一種簡(jiǎn)單，可重復(fù)和微創(chuàng)過程，因此在過去幾十年中，CTCs在腫瘤診斷、復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移中的功

5、能一直在積極研究。但是對(duì)于各亞型循環(huán)腫瘤細(xì)胞與腫瘤復(fù)發(fā)的研究目前卻甚少，本研究通過檢測(cè)PLC患者外周血中的各亞型CTCs，分析其與PLC復(fù)發(fā)的關(guān)系，初步探討各亞型CTCs檢測(cè)在早期預(yù)測(cè)PLC復(fù)發(fā)中的臨床價(jià)值。
　　方法：
　　采集PLC患者外周血，利用多重原位RNA雜交檢測(cè)技術(shù)分離檢測(cè)外周血中的CTCs，并通過細(xì)胞上皮型標(biāo)志物(EpCAM、CK8，18，19)及間質(zhì)型標(biāo)志物(Vimentin、Twist)對(duì)CTCs進(jìn)一步分型

6、，第一組共采集73例入院診斷為肝占位患者的5-mL外周血用來(lái)檢測(cè)CTCs，其中最后入組45位原發(fā)性肝癌患者（年齡中位數(shù):55，范圍:18至77）和13位肝良性病患者（年齡中位數(shù):50，范圍:35至74）。第二組選取2014年3月至2016年3月期間行根治性切除術(shù)的原發(fā)性肝癌患者62例（男:58例，女:4例;年齡:median:55，rang:30～79）行前瞻性研究，均抽取5-mL外周血用來(lái)檢測(cè)CTCs。我們通過采用CanPatrolT

7、MCTCs富集技術(shù)來(lái)檢測(cè)外周血中的EMT表型CTCs。通過使用該技術(shù)，判斷并計(jì)數(shù)不同表型腫瘤細(xì)胞，研究其在PLC中診斷及術(shù)后預(yù)測(cè)復(fù)發(fā)的臨床價(jià)值。
　　統(tǒng)計(jì)學(xué)處理:所有統(tǒng)計(jì)計(jì)算用SPSS v21.0進(jìn)行，P值＜0.05被認(rèn)為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果：
　　應(yīng)用CanPatrolTM系統(tǒng)將檢測(cè)到的外周血中的EMT表型CTCs分成以下三類:上皮型CTCs（上皮標(biāo)記染色），間質(zhì)型CTCs（間質(zhì)標(biāo)記染色），混合型CTCs（上皮

8、和間質(zhì)標(biāo)記染色）同時(shí)，為了檢測(cè)該技術(shù)分離鑒定CTCs的回收效率及敏感性，我們將0，10，50，100，200個(gè)培養(yǎng)的腫瘤細(xì)胞加入健康人的5mL外周血樣本中，與實(shí)際加入的腫瘤細(xì)胞數(shù)目進(jìn)行對(duì)比分析，結(jié)果顯示外周血中分別加入0，10，50，100，200個(gè)HepG2細(xì)胞的平均檢出數(shù)為0，8±1.41，43.33±2.49，85±3.56，182.33±4.99，線性回歸模型分析得到檢出的CTCs與加入的腫瘤細(xì)胞數(shù)量具有明顯線性相關(guān)性(r2=0

9、.999)。通過應(yīng)用該技術(shù)對(duì)PLC及NLD的診斷性研究，首先入組73例診斷為肝占位的患者中;3例患者未行進(jìn)一步診斷，10名患者最終被診斷為其他惡性腫瘤肝轉(zhuǎn)移，45名被診斷為原發(fā)性肝癌，13名被診斷為肝良性病;最終，我們發(fā)現(xiàn)除了上皮型CTCs，其它各類型EMT表型CTCs計(jì)數(shù)在PLC中顯著高于NLD，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。在深入研究EMT表型的CTCs在PLC與復(fù)發(fā)的關(guān)系中，我們?nèi)虢M了62例經(jīng)根治性手術(shù)治療的PLC患者，通過

10、隨訪，26例最終診斷為復(fù)發(fā)，36例診斷為未復(fù)發(fā)。復(fù)發(fā)組與未復(fù)發(fā)組CTCs總數(shù)（中位數(shù):6vs2.5），上皮型CTCs（中位數(shù):0.5vs0），混合型CTCs（中位數(shù):3vs1），間質(zhì)型CTCs（中位數(shù):1vs0）。最終發(fā)現(xiàn);復(fù)發(fā)組CTCs總數(shù)、間質(zhì)型CTCs、混合型CTCs計(jì)數(shù)顯著高于未復(fù)發(fā)患者。為了確定與復(fù)發(fā)相關(guān)的各型CTCs的截點(diǎn)值，行ROC曲線分析定義各型CTCs的截點(diǎn)值:CTCs總數(shù)≥4為陽(yáng)性，間質(zhì)型CTCs≥1為陽(yáng)性，混合型C

11、TCs≥3為陽(yáng)性.經(jīng)多因素cox回歸發(fā)現(xiàn)，門脈癌栓(HR=2.905,P=0.023)及間質(zhì)型CTCs（HR=3.453，P=0.007）陽(yáng)性為復(fù)發(fā)的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。K-M檢驗(yàn)進(jìn)一步研究間質(zhì)型CTCs與復(fù)發(fā)時(shí)間的關(guān)系，結(jié)果發(fā)現(xiàn)間質(zhì)型CTCs陽(yáng)性患者術(shù)后無(wú)瘤生存時(shí)間顯著縮短(P＜0.001)。
　　結(jié)論：
　　1、研究證明了EMT現(xiàn)象存在于原發(fā)性肝癌患者外周血CTCs中;2、外周血中間質(zhì)型CTCs和混合型CTCs計(jì)數(shù)將有望成為診