肝細(xì)胞癌病人外周血中循環(huán)腫瘤細(xì)胞的檢測(cè)和臨床意義.pdf

1、原發(fā)性肝癌(主要是肝細(xì)胞癌，hepatocellular carcinoma，HCC)是世界上最常見的惡性腫瘤之一，位居全球惡性腫瘤發(fā)病率的第5位，發(fā)病率仍持續(xù)升高。目前已成為我國(guó)第二位癌癥死亡原因。盡管近幾十年以來在肝癌診治和基礎(chǔ)研究方面均取得了長(zhǎng)足的進(jìn)步，但總體而言，肝癌的預(yù)后并沒有得到顯著的改善，5年生存率僅為5％左右。手術(shù)切除仍是最主要的治療方法，轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)已成為阻礙HCC病人長(zhǎng)期生存的關(guān)鍵。因此，臨床上迫切需要探索肝癌轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)的

2、相關(guān)預(yù)測(cè)指標(biāo)來優(yōu)化治療方案。對(duì)病人預(yù)后的準(zhǔn)確評(píng)估可對(duì)高危轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)病人增強(qiáng)輔助治療或采用侵襲性較小的治療方案，對(duì)低危轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)病人避免過度治療，從而使實(shí)現(xiàn)治療個(gè)體化，提高病人的生活質(zhì)量。傳統(tǒng)意義上的預(yù)后預(yù)測(cè)指標(biāo)為腫瘤的臨床病理分期和腫瘤細(xì)胞分化分級(jí)，該分期和分級(jí)能大致反映不同病人術(shù)后生存率的差別。但這些臨床病理特征并不能準(zhǔn)確預(yù)測(cè)轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)和病人預(yù)后。生物標(biāo)記物可提供更多信息，有望準(zhǔn)確預(yù)測(cè)轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)。 與腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)的因素均有望成為轉(zhuǎn)

3、移復(fù)發(fā)的預(yù)測(cè)標(biāo)記物。生物標(biāo)記可在組織和體液中檢測(cè)，體液(特別是血液)檢測(cè)不需腫瘤組織標(biāo)本、技術(shù)相對(duì)簡(jiǎn)單、便于在同一患者多次重復(fù)進(jìn)行，易于被患者接受，對(duì)于預(yù)測(cè)轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)的可能性更為重要。外周血中癌細(xì)胞“特異性”標(biāo)記(如 AFP,MAGE、CK19等) mRNA和蛋白檢測(cè)，以及外周血循環(huán)DNA及其遺傳學(xué)異常等均已被用于轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)的預(yù)測(cè)。另一重要方面——外周血循環(huán)腫瘤細(xì)胞 (circulating tumor cells，CTC)的檢測(cè)也已成為近

4、年來研究的熱點(diǎn)。已發(fā)現(xiàn)CTC與多種腫瘤病人的預(yù)后相關(guān)。但其在肝癌病人中的應(yīng)用價(jià)值尚有爭(zhēng)論，主要是因?yàn)椴捎玫臋z測(cè)方法、標(biāo)記分子及引物、對(duì)象人群和樣本采集的部位與時(shí)間不同。 CTC的檢測(cè)與分離技術(shù)有多種。根據(jù)腫瘤細(xì)胞大于血液中有核細(xì)胞的原理分離和富集CTC的方法較為敏感、簡(jiǎn)捷，避免了其它分離過程中引起的細(xì)胞丟失，且不破壞細(xì)胞形態(tài)。本研究中我們采用該方法檢測(cè)HCC病人外周血中的CTC，并聯(lián)合單細(xì)胞全基因組擴(kuò)增技術(shù)和比較基因組雜交技術(shù)(

5、CGH)研究CTC中遺傳學(xué)異常，并探討手術(shù)對(duì)CTC影響及CTC在預(yù)測(cè)腫瘤術(shù)后近期復(fù)發(fā)中的作用。 第一部分肝癌病人外周血循環(huán)腫瘤細(xì)胞的檢測(cè)方法的建立及臨床應(yīng)用 目的：建立一種循環(huán)腫瘤細(xì)胞(CTC)的檢測(cè)方法，檢測(cè)肝癌外周血的CTC及探討手術(shù)對(duì)肝癌病人外周血中CTC數(shù)目的影響。 方法：建立全血濾過富集技術(shù)檢測(cè)外周血中CTC。應(yīng)用肝癌細(xì)胞株 HCC97-L經(jīng)濾過富集后測(cè)定腫瘤細(xì)胞的檢出率以檢測(cè)該方法的敏感性，采用該方法

6、檢測(cè)術(shù)前75例肝細(xì)胞癌(HCC)患者、15例良性病變病人和10例正常健康對(duì)照外周血中CTC。其中18例HCC、10例血管瘤和1例局灶性結(jié)節(jié)狀增生病人術(shù)中再次取血檢測(cè) CTC。用細(xì)胞角蛋白 8/18(CK8/18)行免疫熒光檢測(cè)結(jié)合顯微鏡下形態(tài)學(xué)觀察，判斷并計(jì)數(shù)腫瘤細(xì)胞。 結(jié)果：HCC97-L細(xì)胞檢出率在40％～100％之間，平均為68％；75例HCC病人外周血標(biāo)本中有43(57.3％)例為CTC陽(yáng)性，細(xì)胞數(shù)在1～23之間，其中早

7、期肝癌35例中10例28.6％。對(duì)照組為血管瘤例10，局灶性結(jié)節(jié)狀增生1例，肝囊腫4例，術(shù)前均未發(fā)現(xiàn)CK陽(yáng)性CTC。18例HCC病人術(shù)中檢出率為100％，明顯高于術(shù)前(61％)，且術(shù)中CTC數(shù)目也明顯多于術(shù)前(分別為20.1個(gè)和1.2個(gè))，二者之間差別有顯著意義(P<0.01)。血管瘤和局灶性結(jié)節(jié)狀增生病例術(shù)后可見CK陽(yáng)性細(xì)胞0～1個(gè)。 結(jié)論：全血濾過富集法能簡(jiǎn)單、快速、有效的檢出肝癌病人外周血中CTC，手術(shù)操作明顯增加肝癌病人

8、外周血中CTC數(shù)目。 第二部分循環(huán)腫瘤細(xì)胞的染色體基因組異常研究 目的：檢測(cè)HCC病人CTC的染色體基因組的非平衡性改變，探討采用比較基因組雜交間接證明單個(gè)CTC的良惡性的可行性。 方法：采用激光捕獲顯微切割技術(shù)(LCM) 分離來自第一部分早期(TNM Ⅰ-Ⅱ期)HCC病例中14個(gè)和晚期HCC病例(TNM Ⅲ-Ⅳ期)中的16個(gè)循環(huán)腫瘤細(xì)胞，單細(xì)胞全基因組擴(kuò)增技術(shù)擴(kuò)增所有分離的單個(gè)細(xì)胞的全基因組DNA，采用比較基因

9、組雜交技術(shù)(CGH)檢測(cè)細(xì)胞的染色體基因組異常。結(jié)果：激光捕獲顯微切割30個(gè)成功29個(gè)，成功率97％；單細(xì)胞擴(kuò)增29個(gè)成功27個(gè)，成功率93％；CGH結(jié)果顯示27個(gè)單細(xì)胞中有22個(gè)有不同程度的染色體改變，其中早期病例13個(gè)細(xì)胞中9個(gè)有染色體異常，晚期病例14個(gè)中有13個(gè)有染色體異常。CTC中常見的擴(kuò)增位置有1q、6p、8q，常見的缺失有 1p、4q、8p、13q、16q、17p。其中9個(gè)早期肝癌CTC中有1個(gè)存在8p缺失，13個(gè)晚期肝癌

10、CTC中有8個(gè)存在8p缺失，二者之間的差別有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。 結(jié)論：?jiǎn)渭?xì)胞全基因組擴(kuò)增產(chǎn)物可用于比較基因組雜交。比較基因組雜交技術(shù)可以間接證明單個(gè)CTC的良惡性，大部分CTC有基因組的改變。肝癌循環(huán)腫瘤細(xì)胞中最常見 1q、6p、8q 擴(kuò)增的和 1p、4q、8p、13q、16q、17p的缺失。 第三部分肝細(xì)胞癌患者外周血中循環(huán)腫瘤細(xì)胞的臨床意義和預(yù)后價(jià)值研究 目的：探討CTC在HCC外周血中的臨床意

11、義和預(yù)后價(jià)值。 方法：采用濾過富集法檢測(cè) 75 例 HCC 患者、15 例良性病變病人和 10 例正常健康對(duì)照的外周血中CTC，用細(xì)胞角蛋白8/18(CK8/18)行免疫熒光檢測(cè)結(jié)合顯微鏡下形態(tài)學(xué)觀察，判斷并計(jì)數(shù)腫瘤細(xì)胞。 結(jié)果：HCC 早期(Ⅰ-Ⅱ期)病人，CTC的陽(yáng)性率為28.6％；晚期(Ⅲ-Ⅳ期)時(shí)，為 82.5％。兩者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。HBsAg、血清AFP水平、肝硬化、有無包膜和Edmondso

12、n分級(jí)與CTC數(shù)目無關(guān)(P>0.05)；單發(fā)腫瘤63例中33例陽(yáng)性，多發(fā)腫瘤12例10例陽(yáng)性，兩組之間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0．05)；大腫瘤組(>5cm)38例中30例陽(yáng)性，小腫瘤組(≦5cm)37例中13例陽(yáng)性，兩組之間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；外周血中檢測(cè)到CTC與肝癌病人術(shù)后一年總體生存率和無瘤生存率的減少有關(guān)。 結(jié)論：全血濾過富集法檢測(cè)肝癌外周血CTC發(fā)現(xiàn)部分早期腫瘤已有腫瘤細(xì)胞的血源性播散；隨著腫瘤進(jìn)展血