食管鱗癌外周血循環(huán)腫瘤細胞檢測及臨床意義.pdf

1、一、研究背景：
　　 食管癌是我國常見的惡性腫瘤，發(fā)病率在男性中位居第四位，其中鱗狀細胞癌是主要的病理類型。隨著醫(yī)學水平的進步，也經(jīng)過我國廣大醫(yī)務工作者的不懈努力，食管癌的發(fā)病率和死亡率有了明顯改善。然而，雖經(jīng)積極手術治療，同時結(jié)合術前新輔助、術后輔助化療，術前新輔助、術后輔助放療及免疫生物治療、中醫(yī)中藥等多種綜合治療方案，食管癌的五年生存率仍然維持在30％左右，30多年來沒有明顯增加，究其原因是腫瘤的轉(zhuǎn)移和復發(fā)。相當一部分患者

2、，就診時腫瘤分期較低，治療前也無明顯轉(zhuǎn)移證據(jù)，在行腫瘤根治術后卻早期死于腫瘤的復發(fā)轉(zhuǎn)移。這說明，存在用常規(guī)臨床檢驗和組織病理學方法不能檢出的癌細胞播散或隱性轉(zhuǎn)移。目前常用的腫瘤檢測方法包括影像檢查及血液中相關腫瘤標記物檢測。影像學檢查只能發(fā)現(xiàn)生長到一定大小的腫瘤，如大于1cm的腫瘤，但等到影像學發(fā)現(xiàn)時往往已經(jīng)失去了最佳治療的機會。血液中相關腫瘤標記物是早期發(fā)現(xiàn)腫瘤的一種方法，比如不同的mRNA標記物、循環(huán)DNA標記物、循環(huán)腫瘤細胞端粒酶

3、等，但這些標志物的特異性較差，易導致假陽性結(jié)果，難以提供精確的臨床信息。而活體組織病理檢查雖然是腫瘤診斷的金標準，但取得活體組織的方法創(chuàng)傷較大，也不能隨時進行，無法很好的評價腫瘤的發(fā)生發(fā)展及復發(fā)轉(zhuǎn)移。近年來，隨著對循環(huán)腫瘤細胞研究的深入，人們發(fā)現(xiàn)了將循環(huán)腫瘤細胞作為一種微創(chuàng)、準確的方法來評價腫瘤復發(fā)轉(zhuǎn)移具有廣闊的應用前景。隨著免疫磁珠、納米免疫磁珠、多色熒光標記和生物細胞分選芯片等細胞分選技術、RT-PCR等分子技術的快速發(fā)展，從外周血

4、分離、富集血液中的稀有細胞即循環(huán)腫瘤細胞成為可能。但循環(huán)腫瘤細胞分離、富集和鑒定的方法國際上尚無公認的標準，不同檢測方法的結(jié)果差異也較大，一定程度上阻礙了循環(huán)腫瘤細胞的深入研究。雖然如此，很多基于不同方法的循環(huán)腫瘤細胞的研究報道都證實了循環(huán)腫瘤細胞可能與腫瘤復發(fā)、轉(zhuǎn)移及預后相關，隨時檢測循環(huán)腫瘤細胞有助于評價患者的腫瘤進展情況，可以在出現(xiàn)癥狀、腫瘤播散前及時采取必要的治療方案，最大限度地抑制腫瘤進展，同時，動態(tài)監(jiān)測腫瘤不同治療階段循環(huán)腫

5、瘤細胞的變化有助于評價治療方案的有效性，據(jù)此隨時調(diào)整治療方案，選擇最佳的個體化治療方案，以提高腫瘤患者的治療效果，延長生存時間，改善生活質(zhì)量。因此，在目前的個體化治療模式下，循環(huán)腫瘤細胞可以對個體化治療方案的確定提供強有力的依據(jù)。現(xiàn)在，對實體瘤外周血循環(huán)腫瘤細胞的研究越來越受到人們的關注，對各種實體瘤的循環(huán)腫瘤細胞的研究日益深入，對乳腺癌、結(jié)直腸癌、前列腺癌等惡性腫瘤循環(huán)腫瘤細胞的研究較多，也取得了很多有意義的結(jié)果。而目前有關食管鱗癌循

6、環(huán)腫瘤細胞的檢測方法及臨床意義的研究很少。
　　 二、目的：
　　 本實驗采用基于負性篩選策略的免疫熒光染色技術檢測食管鱗癌患者外周血循環(huán)腫瘤細胞，評價該方法檢測食管鱗癌循環(huán)腫瘤細胞的效用，嘗試建立一種簡便、快速、高效的食管鱗癌循環(huán)腫瘤細胞檢測方法，同時探討食管鱗癌外周血中循環(huán)腫瘤細胞的檢出水平的臨床意義，分析術前血食管鱗癌循環(huán)腫瘤細胞數(shù)量與臨床病理特征的相關關系，分析術前、術后血循環(huán)腫瘤細胞不同檢出水平組的無展生存時間

7、的差異，評估食管鱗癌患者外周血循環(huán)腫瘤細胞與腫瘤進展程度的關系，為外周血CTCs作為食管鱗癌患者的預后評價提供證據(jù)。
　　 三、材料和方法：
　　 1、材料
　　 采集海軍總醫(yī)院胸外科2009年4月-2010年8月收治的48例食管鱗癌患者的術前一天、術后七天的清晨空腹外周靜脈血，共96例標本?；颊呒{入和排除標準:術前明確診斷的食管鱗癌初治患者，術前未行放化療及其他抗腫瘤治療，知情同意。
　　 回顧分析患者

8、臨床病理特征和隨訪資料，研究時限為術后34個月。無進展生存時間(Progression-freeSurvival，PFS)為手術后到腫瘤復發(fā)時間。詳細記錄患者的臨床信息，包括性別、年齡、腫瘤部位、腫瘤分化程度、腫瘤大小及侵犯程度、腫瘤分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移狀態(tài)、p-TNM分期、腫瘤復發(fā)時間、術前、術后CTCs數(shù)量。
　　 2、方法
　　 于術前一天、術后七天采集食管鱗癌患者清晨空腹外周靜脈血7.5ml，24小時內(nèi)富集腫瘤細

9、胞。用紅細胞裂解液去除食管鱗癌外周血樣本中的紅細胞，用Miltenyi免疫磁珠去除白細胞，富集上皮來源的稀有細胞，用免疫熒光染色技術鑒定循環(huán)腫瘤細胞。經(jīng)過Mitineyi磁珠富集后，食管鱗癌患者外周血檢出CK8/18/19角蛋白抗原陽性/CD45白細胞表面抗原陰性的上皮來源細胞，同時，可見CK8/18/19陰性/CD45陽性的白細胞。
　　 3、循環(huán)腫瘤細胞數(shù)量與臨床病理意義的分析
　　 目前乳腺癌循環(huán)腫瘤細胞的研究較為

10、成熟，F(xiàn)DA于2004年批準CellSearch系統(tǒng)用于檢測乳腺癌患者外周血循環(huán)腫瘤細胞輔助療效評價和預后判斷，該系統(tǒng)研究證實，采用循環(huán)腫瘤細胞數(shù)量界定5來判斷療效及預后分析有臨床意義。在其他實體腫瘤循環(huán)腫瘤細胞的研究中，也多選擇3個或5個為陽性結(jié)果界定標準，如前列腺癌、結(jié)直腸癌循環(huán)腫瘤細胞數(shù)量陽性界定值為3。各種實體腫瘤循環(huán)腫瘤細胞研究也證實，相當比例患者外周血中并未檢出循環(huán)腫瘤細胞，循環(huán)腫瘤細胞數(shù)量的分布呈偏態(tài)分布，不能直接用循環(huán)腫

11、瘤細胞的數(shù)量作為腫瘤分期及復發(fā)轉(zhuǎn)移的判斷標準。國內(nèi)外至今尚無食管癌循環(huán)腫瘤細胞數(shù)量陽性判定標準，本實驗參考其他實體腫瘤循環(huán)腫瘤細胞研究，數(shù)量小于3個為檢出陰性，大于等于3個為檢出陽性。對食管鱗癌患者術前血循環(huán)腫瘤細胞與患者的臨床病理特征進行統(tǒng)計學分析，包括性別、年齡、腫瘤位置、細胞分化程度、原發(fā)腫瘤侵犯程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移狀態(tài)及p-TNM分期。分別分析術前、術后血循環(huán)腫瘤細胞不同檢出水平組的無展生存時間的差異。
　　 4、數(shù)據(jù)統(tǒng)計<

12、br>　　 等級變量的相關分析采用Spearman相關分析;用x2檢驗或Fisher確切概率法分析原發(fā)腫瘤侵犯程度、細胞分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移狀態(tài)、腫瘤TNM分期與CTCs檢出水平之間的關系。采用Kaplan-Meier法分析病人的無進展生存時間，比較不同CTCs水平患者的中位無進展生存時間。用log-rank檢驗行組間無進展生存時間的比較。所有的統(tǒng)計分析用SPSS13.0統(tǒng)計軟件完成，以P＜0.05為具有顯著性差異。
　　 四

13、、結(jié)果：
　　 1、經(jīng)過Mitineyi磁珠富集后，食管鱗癌患者外周血循環(huán)腫瘤細胞檢出率為64.6％(31/48)，中位數(shù)2(0-72)。術后外周血循環(huán)腫瘤細胞檢出率相同，為64.6％(31/48)，中位數(shù)2(0-36)。術前血循環(huán)腫瘤細胞檢出陽性與細胞分化程度(R=0.431，P=0.002)、原發(fā)腫瘤侵犯程度(R=0.403，P=0.005)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移狀態(tài)(R=0.339，P=0.019)及p-TNM分期(R=0.394，

14、P=0.006)有顯著相關關系。分化程度越低(x2=9.636，P=0.008)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移越多(x2=4.218，P=0.040)、p-TNM分期越晚(x2=8.392，P=0.004)，CTCs檢出陽性率越高。
　　 2、術前組CTCs＜3和CTCs≥3兩組的中位無進展生存時間分別為20個月(95％可信區(qū)間17.134-22.866)和13個月(95％可信區(qū)間11.161-14.839)，術后血CTCs＜3和CTCs≥3兩組

15、的中位無進展生存時間為分別為20個月(95％可信區(qū)間16.763-23.237)和13個月(95％可信區(qū)間11.518-14.482)。術前、術后血循環(huán)腫瘤細胞檢出陽性組的術后無進展生存時間較檢出陰性組低，有顯著統(tǒng)計學差異。(術前組x2=9.403，P=0.002，術后組x2=23.049，P=0.000)
　　 五、結(jié)論：
　　 1、基于負性篩選策略的免疫熒光技術，可以有效分離、富集、鑒定食管鱗癌患者外周血循環(huán)腫瘤細胞

16、，檢出率與其他實體腫瘤檢出率相近。
　　 2、食管鱗癌患者術前血循環(huán)腫瘤細胞檢出水平與腫瘤分化程度、原發(fā)腫瘤侵犯程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移狀態(tài)、p-TNM分期有顯著相關關系，與患者性別、年齡、腫瘤的位置無顯著相關關系。
　　 3、食管鱗癌患者血循環(huán)腫瘤細胞檢出陽性組較循環(huán)腫瘤細胞檢出陰性組無進展生存時間顯著降低。
　　 4、食管鱗癌患者外周血循環(huán)腫瘤細胞的檢出水平可以反應腫瘤的進展程度，可以作為食管鱗癌患者的預后評價指標之