家蠶黃繭限性品種雌雄SAGE文庫的構(gòu)建及其差異表達(dá)基因的研究.pdf

1、摘要家蠶（Bombyxmi）作為生產(chǎn)用經(jīng)濟(jì)昆蟲，雄性在體質(zhì)、絲蛋白質(zhì)合成效率和蠶絲品質(zhì)等方面都優(yōu)于雌性，其調(diào)控機(jī)理目前還了解很少。限性遺傳是家蠶的一種應(yīng)用廣泛的遺傳方式，其中繭色限性遺傳方式，與斑紋限性一樣廣泛用于蠶種生產(chǎn)過程的雌雄分離制種。家蠶天然有色繭是具有重大應(yīng)用前景的遺傳資源，有色繭的繭絲顏色種類、色度、色牢度、色勻度等繭色相關(guān)遺傳控制，不僅僅受數(shù)十個（推測）色素結(jié)合與轉(zhuǎn)運(yùn)主基因控制，還受到更加復(fù)雜的基因網(wǎng)絡(luò)影響，分子遺傳研究表

2、明相關(guān)基因未完全確認(rèn)。家蠶黃繭限性品種（雌為黃繭，雄為白繭），為研究黃、白繭之間差異表達(dá)基因提供了非常好的材料。本文使用該系統(tǒng)Ysh蠶品種，構(gòu)建了不同性別的LongSAGE表達(dá)譜文庫，篩選了差異表達(dá)基因。通過構(gòu)建的apEST電子表達(dá)譜、在線芯片表達(dá)譜平臺（BmMDB）的查詢以及RTPCR、RealTimePCR、免疫組化和Westernblotting等實驗技術(shù)，調(diào)查了雌雄差異表達(dá)基因在Ysh及其它幾個品種中的時空表達(dá)譜、激素處理和限食

3、處理后的基因調(diào)控變化，測定了相關(guān)品種組織中的總蛋白酶和胰蛋白酶活性，并對絲氨酸蛋白酶前體（SPP）和絲氨酸蛋白酶抑制劑1（SPI1）進(jìn)行了蛋白水平上的調(diào)查，獲得的主要結(jié)果如下。1apEST提供了電子表達(dá)譜的查詢與分析平臺構(gòu)建了基于家蠶dbEST為數(shù)據(jù)源（截止2011年3月20有316223條EST）的基因電子表達(dá)譜分析平臺（apEST）（:jysw.suda.bombyxDownload.html）。通過和其它基因表達(dá)譜分析平臺的比較，

4、明確了其可靠性和可行性。該平臺能為挖掘特異性基因提供有利參考，在本實驗室已進(jìn)行了廣泛的應(yīng)用。2構(gòu)建了黃繭限性系統(tǒng)雌雄的LongSAGE文庫根據(jù)家蠶幼蟲色素快速積累時期和組織特異性，構(gòu)建了以整個5齡幼蟲期中腸和絲腺為材料的的Ysh蠶品種雌雄LongSAGE文庫，總共獲得了32099個標(biāo)簽，篩選出202個差異標(biāo)簽（Tag），其中108個Tag在雌性中上調(diào)表達(dá)，94個Tag在雄性中上調(diào)表達(dá)。借助家蠶全基因組公共數(shù)據(jù)庫，通過參考文庫和改進(jìn)的GL

5、GI方法，對其中76個Tag進(jìn)行了注釋，為繭色相關(guān)基因發(fā)掘，特別是色素結(jié)合與轉(zhuǎn)運(yùn)主基因以外的新基因發(fā)掘創(chuàng)造了平臺。SAGE文庫提供的大量性別差異標(biāo)簽，得到其全長并進(jìn)行功能研究對于闡明限性黃繭品種雌雄差異性狀機(jī)理是有價值的。3絲氨酸蛋白酶（SPs）和絲氨酸蛋白酶抑制劑（Serpins）是互作關(guān)系的酶類在家蠶Ysh品種5齡前中期，幼蟲中腸特異表達(dá)的SPs基因的mRNA表達(dá)量，以及胰蛋白酶活性都高于5齡末期，也高于眠期，同時眠期檢測不到SPP

6、蛋白的表達(dá)。Spp基因受饑餓處理的瞬時調(diào)控，推測食物進(jìn)入中腸后誘導(dǎo)了參與中腸食物蛋白質(zhì)消化與吸收的SPs分泌，后者又啟動了SPs基因的表達(dá)，而停止喂食，蛋白酶分泌也停止。SPs的表達(dá)特征提供了SPs參與中腸食物蛋白的分子證據(jù)。SPs基因在5齡后期雌蠶的中腸表達(dá)量高于雄性，推測與雌性造卵需要更多的蛋白質(zhì)營養(yǎng)有關(guān)。TheSAGEconstructionbetweenmalesfemalesofyellowcocoonsexlimitedst

7、rainYshtheresearchondifferentlyexpressedgenesinsilkwm，BombyxmiAbstractThedomesticatedsilkwmBombyxmiservesasanimptantlyeconomicinsect.Asisknowntoallmalesilkwmsarebetterthanfemalesinrespectofphysicalqualitiessyntheticeffic

8、iencyofsilkproteinssilkqualities.Atpresenttheregulatymechanismsarenotthoughlyclear.ThesexlimitedheredityiswidelyobtainedinBombyxmiinwhichthecocooncolsexlimitedinheritedmethodlikethestripesexlimitedisappliedtoseparatemale

9、sfemalesinsilkwmbreeding.Naturalcoledcocoonsaregeicresourceswithapromisingsignificantapplicationfuture.Geiccontrolsrelatedtosilkcolkindschromacolfastnesscolwelldegreesareinfluencednotonlybytensmaingenes(predicted)ofpigme

10、ntcombinationtransptationbutmecomplicatedgenes.Moleculargeicssuggeststhatithasn’tbeenconfirmedoftherelatedgenesyet.Theyellowcocoonsexlimitedstrain(femalecocoonsareyellowwhilemalecocoonsarewhite)providesexcellentmaterials

11、toresearchdifferentlyexpressedgenesbetweenyellowwhitecocoons.ThisstudyconstructedLongSAGElibrariesofYshstrainscreeneddifferentlyexpressedgenes.Inthisstudythespatiotempalexpressionpatternsgeneregulationchangesafterthetrea

12、tmentwithhmonefoodlimitationwereinvestigatedmeanwhiletheactivitiesoftotalproteinasetrypsinweremeasuredwithtworepresentativegenesresearchedatthelevelofproteinsbyconstructingapESTelectronicexpressionprofilequeryingonlineBm

13、MDBsomeexperimentaltechnologiessuchasRTPCRRealTimePCRimmunohistochemistryWesternblotting.Themainresultsareasfollows:1apESTprovidestheplatfmtoobtainanalyzeelectronicexpressionprofilesGeneelectronicexpressionprofileanalysi

14、splatfm（apEST）wasconstructedbasedonthedataresourcesofBombyxmidbEST(:jysw.suda.bombyxDownload.html).(316223ESTsbyMar.202011).Comparedwithotherplatfmsprovidinggeneelectronicexpressionprofileanalysisthereliabilityfeasibilit

15、yofourshavebeenensured.Thisplatfmcanprovideadvantageousreferencestounearthspecialgeneswhichhasbeenwidelyusedinourlabaty.2TheconstructionofLongSAGElibrariesbetweenthemalesfemalesoftheyellowcocoonsexlimitedstrainYshAccding

16、tothetissuespecificitythestagewhenpigmentisrapidlyaccumulatedinlarvaetheLongSAGElibrariesbetweenthemalesfemaleswereconstructedbasedonthematerialsofthegutsilkglofthefifthinstarlarvae.Atotalnumberof32099tagswereobtainedofw