SDH2基因在白念珠菌致病性中的作用及其機(jī)制研究.pdf

1、白念珠菌是一種常見(jiàn)的人類致病真菌。它在侵襲宿主的過(guò)程中可以進(jìn)行酵母態(tài)-菌絲態(tài)的形態(tài)轉(zhuǎn)換，該形態(tài)轉(zhuǎn)換也是白念珠菌致病機(jī)制研究的重點(diǎn)。本課題前期研究利用線蟲模型篩選白念珠菌基因突變菌庫(kù)，試圖發(fā)現(xiàn)影響致病力的關(guān)鍵因子，研究發(fā)現(xiàn)白念珠菌SDH2基因突變菌在線蟲模型上致病力完全喪失且菌絲形成能力產(chǎn)生缺陷，具有研究?jī)r(jià)值。SDH2基因參與編碼的蛋白同時(shí)在三羧酸(Tricarboxylic acid，TCA)循環(huán)和線粒體電子傳遞鏈（Electron t

2、ransport chain，ETC）中發(fā)揮功能，在TCA循環(huán)中是琥珀酸脫氫酶（Succinate dehydrogenase，SDH），同時(shí)還是線粒體電子傳遞鏈的復(fù)合體Ⅱ，是有氧呼吸過(guò)程中發(fā)揮重要作用的酶。
　　我們前期以野生型白念珠菌SC5314為親本菌，利用SAT-flipper方法重新構(gòu)建了SDH2缺失菌sdh2△/△。該基因敲除方法的優(yōu)勢(shì)在于利用諾爾絲菌素(Nourseothricin)抗性標(biāo)記篩選陽(yáng)性克隆，諾爾絲菌素抗

3、性標(biāo)志基因可在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中被完整剔除，避免營(yíng)養(yǎng)缺陷標(biāo)志基因?qū)χ虏×Φ母蓴_。在線蟲模型和小鼠模型上，sdh2△/△致病力顯著降低并且菌絲形成能力缺陷。在體外實(shí)驗(yàn)中，我們發(fā)現(xiàn)sdh2△/△在不同是菌絲誘導(dǎo)培養(yǎng)基上都顯示出菌絲形成能力缺陷，且利用非發(fā)酵碳源障礙。但值得注意的是，在含可發(fā)酵碳源葡萄糖的菌絲誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，sdh2△/△依然不能形成正常的菌絲。
　　我們深入研究了SDH2基因影響菌絲形成的機(jī)制。由于sdh2△/△的生長(zhǎng)在很大程度

4、上依賴可發(fā)酵碳源，我們首先考察了SDH2基因缺失菌的固體菌絲形成缺陷是否與糖酵解的代謝產(chǎn)物乙醇有關(guān)。我們推測(cè)sdh2△/△中乙醇可能發(fā)生了累積，依據(jù)是敲除SDH2基因后TCA循環(huán)中SDH的功能受到影響，可能導(dǎo)致TCA循環(huán)受阻，從而影響白念珠菌有氧呼吸過(guò)程，其代謝方式可能由有氧呼吸轉(zhuǎn)變?yōu)樘墙徒?，在固體培養(yǎng)基上，糖酵解產(chǎn)生的乙醇副產(chǎn)物很可能積累在細(xì)胞內(nèi)不能及時(shí)排出。經(jīng)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，SDH2基因缺失菌的確存在胞內(nèi)乙醇累積的現(xiàn)象，接下來(lái)我們通過(guò)3部

5、分實(shí)驗(yàn)對(duì)乙醇與白念珠菌菌絲形成的關(guān)系進(jìn)行探究:①外加乙醇考察固體菌絲形成;②利用工具藥丙二酸（琥珀酸類似物，競(jìng)爭(zhēng)性抑制琥珀酸脫氫酶活性從而阻斷TCA循環(huán)過(guò)程）阻斷有氧呼吸過(guò)程考察胞內(nèi)乙醇含量和固體菌絲形成;③考察ADH1基因（編碼乙醇脫氫酶，催化乙醛還原到乙醇及其逆反應(yīng)）敲除菌adh1△/△胞內(nèi)乙醇含量和固體菌絲形成，但得到的結(jié)果不能支持這個(gè)結(jié)論。首先，我們發(fā)現(xiàn)在不同固體培養(yǎng)基中，乙醇對(duì)菌絲的影響并不一致，2～4％的乙醇在YPD+胎牛血

6、清培養(yǎng)基中反而刺激了菌絲的形成。其次，丙二酸確實(shí)能夠抑制有氧呼吸過(guò)程，并令胞內(nèi)乙醇累積，但相應(yīng)的固體菌絲形成并沒(méi)有產(chǎn)生缺陷。此外，adh1△/△胞內(nèi)乙醇含量明顯低于野生型白念珠菌，但固體菌絲形成能力并沒(méi)有更強(qiáng)，且對(duì)外加乙醇的敏感性也并沒(méi)有低于野生型?？偟膩?lái)說(shuō)，白念珠菌胞內(nèi)乙醇含量與菌絲形成能力沒(méi)有明確的正相關(guān)關(guān)系。
　　由于SDH2基因同時(shí)在TCA循環(huán)和ETC發(fā)揮作用，我們進(jìn)一步探究了是TCA循環(huán)還是ETC功能受損影響了菌絲形成。

7、本部分實(shí)驗(yàn)選取丙二酸(Malonate)和萎銹靈(Carboxin)兩種SDH不同功能位點(diǎn)的特異性抑制劑，和白念珠菌TCA循環(huán)特異性基因FUM12敲除菌fum12△/△作為考察工具。丙二酸特異性抑制SDH在TCA循環(huán)中催化琥珀酸脫氫為延胡索酸的功能，萎銹靈特異性抑制SDH在ETC中傳遞電子到泛醌的功能，F(xiàn)UM12基因編碼TCA循環(huán)中延胡索酸脫氫酶，基因敲除后TCA循環(huán)受阻。我們發(fā)現(xiàn)野生型白念珠菌施加1.5 mM的萎銹靈后，菌絲形成能力顯

8、著下降并導(dǎo)致致病力降低，能夠重現(xiàn)出SDH2基因敲除后致病力和菌絲形成能力缺陷的現(xiàn)象，而相同濃度下丙二酸和敲除FUM12基因不能夠影響白念珠菌致病力和菌絲形成能力。由此我們推斷，sdh2△/△中ETC的功能受損是導(dǎo)致菌絲缺陷的主要原因，而菌絲形成主要與ETC相關(guān)，而非TCA循環(huán)過(guò)程。
　　我們進(jìn)一步研究了ETC功能影響菌絲形成機(jī)制。我們首先考察了sdh2△/△一系列線粒體功能指標(biāo)和活性氧(Reactive oxygen specie

9、s，ROS)產(chǎn)生，發(fā)現(xiàn)sdh2△/△的ATP含量和線粒體膜電位與野生型沒(méi)有顯著差別，但ROS含量明顯高于野生型，排除了ATP不足以及線粒體膜電位異常導(dǎo)致基因缺失菌菌絲缺陷的可能，并推測(cè)ROS積累是可能原因。我們通過(guò)對(duì)sdh2△/△外加還原性物質(zhì)（維生素E，原花青素）和對(duì)野生型外加ROS誘導(dǎo)物質(zhì)改變胞內(nèi)ROS水平，考察內(nèi)源性ROS對(duì)固體菌絲形成能力的影響。發(fā)現(xiàn)外加還原性物質(zhì)后sdh2△/△菌絲形成能力能夠恢復(fù)，且ROS誘導(dǎo)物質(zhì)的確可以抑制

10、白念珠菌菌絲形成。此外，我們通過(guò)降低環(huán)境中氧含量(缺氧條件，20％CO2)減少有氧呼吸進(jìn)而減少胞內(nèi)ROS產(chǎn)生，研究發(fā)現(xiàn)sdh2△/△在低氧條件下菌絲形成能力與野生型無(wú)異。綜合上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果，我們推測(cè)白念珠菌SDH2基因敲除后造成ROS積累是導(dǎo)致菌菌絲形成缺陷的主要原因。
　　本課題揭示了SDH2基因敲除后通過(guò)影響ETC功能提高了細(xì)胞內(nèi)ROS產(chǎn)生，從而導(dǎo)致白念珠菌菌絲形成能力以及致病力顯著下降。該研究提示白念珠菌線粒體電子傳遞鏈相關(guān)基