體內獲得性耐藥進程中白念珠菌表型和基因表達變化的研究.pdf

1、本文主要從以下幾個部分展開論述：
　　第一章 體內獲得性耐藥進程中白念珠菌表型變化的研究
　　目的:初步探索白念珠菌在體內獲得性耐藥進程中出現(xiàn)的表型改變。方法:選用6株同一來源的在體內氟康唑長期作用下耐藥性逐漸增強的一組白念珠菌（編號分別為Ca1、2、5、8、14、17，其中Ca1為用藥前），進行形態(tài)學研究、菌絲形成實驗、表面疏水性(CSH)實驗以及絮凝實驗，探索白念珠菌在體內獲得性耐藥這一過程中形態(tài)結構、菌絲形成能力、黏附

2、性的變化。結果:實驗菌株的形態(tài)和超微結構以及細胞間的黏附能力未見明顯改變。除Ca17外，Ca2、5、8、14的菌絲形成率和CSH值都明顯比用藥前的敏感株Ca1高。結論:實驗菌株的菌絲形成能力、與宿主或非生命基質間的黏附能力在獲得性耐藥的過程中發(fā)生了相應的變化，這種改變的確切機制和意義尚有待進一步研究。
　　第二章 體內獲得性耐藥進程中白念珠菌生物膜形成能力及其藥物敏感性變化的研究
　　第一節(jié) 體內獲得性耐藥進程中白念珠菌生物

3、膜形成能力的研究
　　目的:對實驗菌株進行生物膜構建及結構觀察，并比較在體內獲得性耐藥進程中各菌株生物膜形成能力的差異。方法:用24孔組織培養(yǎng)板構建第一章所用6株菌的生物膜，在不同的培養(yǎng)時間(2、4、8、12、24h)置于倒置顯微鏡下對生物膜的形成過程進行觀察;生物膜成熟后，用共聚焦激光掃描顯微鏡觀察比較各菌株生物膜形成情況;用甲基四氮鹽(XTT)減低法評價生物膜生長過程中活力的變化。結果:實驗菌株的生物膜形成能力存在差異，根據(jù)生

4、物膜形成能力的不同，可將實驗菌株分為:形成能力弱（用藥前的敏感株和用藥后耐藥程度最高的菌株）和形成能力強（兩者之間的4株菌，可理解為敏感和高度穩(wěn)定耐藥之間的過渡狀態(tài)）兩組。結論:在獲得性耐藥這一進程中菌株的生物膜形成能力會發(fā)生改變，這種變化可能在對抗藥物選擇性壓力中扮演重要角色。
　　第二節(jié) 體內獲得性耐藥進程中白念珠菌藥物敏感性變化的研究
　　目的:比較在體內獲得性耐藥進程中，懸浮狀態(tài)菌與生物膜狀態(tài)菌對抗真菌藥物敏感性的差

5、異。方法:參照CLSI-M27-A3法推薦的酵母菌微量液基稀釋法對浮游狀態(tài)菌株進行常用抗真菌藥(氟康唑、伊曲康唑、伏立康唑、卡泊芬凈和兩性霉素B)藥物敏感性的測定;在96孔組織培養(yǎng)板中構建白念珠菌生物膜的體外模型，參照Pierce的生物膜藥物敏感性試驗方法對其進行藥物敏感性測定。結果:實驗菌株在浮游狀態(tài)對卡泊芬凈和兩性霉素B均維持敏感，對氟康唑、伊曲康唑和伏立康唑的MIC值呈梯度性增高，其中Ca17對三種唑類藥物均耐藥。所有實驗菌株在形

6、成生物膜后，對氟康唑呈高度耐藥，對伊曲康唑和伏立康唑的耐藥性也顯著增加，兩性霉素B可在較高濃度抑制白念珠菌生物膜，卡泊芬凈對白念珠菌生物膜仍維持敏感。結論:在獲得性耐藥形成過程中，白念珠菌的藥物敏感性逐漸下降。與游離狀態(tài)相比，生物膜對藥物的抵抗性更強。唑類藥物耐藥程度增加最明顯;兩性霉素B在較高濃度可抑制白念珠菌生物膜，但其副作用大，臨床應用受限;卡泊芬凈對白念珠菌生物膜的殺傷作用較強，可作為臨床抗白念珠菌生物膜感染的一線藥物。

7、　　第三章 體內獲得性耐藥進程中實驗菌株轉錄組測序和分析
　　目的:研究白念珠菌在體內獲得性耐藥進程中基因的表達變化。方法:對第一章所用6株株進行轉錄組測序(RNA-seq)，比較親本和MIC值最高的菌株之間的基因表達差異以及隨MIC逐漸升高有顯著改變的基因;進行相關基因的功能注釋及生物學通路分析等研究。結果:Ca17與Ca1相比，共有55條基因表達差異明顯，其中有49條基因表達明顯上調，6條基因表達明顯下調。上調幅度最大的是MD

8、R1，其次是CDR1、CDR2等。首次發(fā)現(xiàn)在用藥前后出現(xiàn)明顯改變的基因有HWP1、GLX3、GEF2、HSL1、MED9、OYE32、PS19A、HST、NAD4、NAD5、NAD4L、PGA31、GST3等。表達上調的差異基因多與耐藥和氧化應激相關。隨MIC逐漸升高有相關關系改變的基因共有655條，其中顯著改變的有303條，差異基因主要富集在與代謝有關的功能和生物通路上。結論:白念珠菌獲得性耐藥的最終形成是多個基因在不同時段通過不同的