小檗堿與咪康唑協(xié)同抗耐藥白念珠菌作用及其機制研究.pdf

1、對于健康個體而言，真菌一般是條件致病菌，當機體抵抗力下降、外界一些因素作用，有可能造成全身或局部真菌感染。按國際醫(yī)學界的通用標準，真菌按最初感染時的部位分為3種類型：淺表性真菌病、皮下真菌感染和系統(tǒng)性真菌感染。
　　 咪康唑是高效、安全、廣譜的抗真菌藥，對致病性真菌幾乎都有作用。其機理是抑制真菌細胞膜的固醇合成，影響細胞膜通透性，抑制真菌生長，導致死亡。在4微克/毫升以下的濃度可抑制大部分臨床分離的真菌，其中新型隱球菌，念珠菌和

2、粗孢子菌對本品均敏感，皮炎芽生菌和組織胞漿菌對本品高度敏感，但曲霉菌較差。另外，咪康唑?qū)鹌暇玩溓蚓案锾m陽性球菌和炭疽菌等也有抗菌作用。硝酸咪康唑乳膏常見的外用制劑，臨床偶爾也用于靜脈滴注，但是副作用大，有肝毒性甚至能引起心臟驟停。此外，由于長期大量使用抗真菌藥物，真菌對藥物的敏感性下降，咪康唑所針對的真菌也不例外。
　　 臨床上常用于提高耐藥真菌治療效果的方法有：增大劑量，改變藥物類型，兩藥或多藥協(xié)同。兩藥協(xié)同有很多優(yōu)勢，

3、如降低其中毒性較大藥物的劑量，提高藥物治療效果，增加抗真菌譜，延緩真菌耐藥性產(chǎn)生等。天然產(chǎn)物物種豐富，可作為抗真菌藥物增敏劑的來源之一，一般選取結(jié)構明確的單體做研究。
　　 小檗堿又稱黃連素，是一種常見的異喹啉生物堿，存在于小檗科等四個科十個屬的許多植物中，資源豐富。小檗堿具有抗菌，解熱抗炎，調(diào)節(jié)血脂，治療糖尿病等藥理活性，并且安全性高。
　　 實驗室前期研究中已發(fā)現(xiàn)小檗堿與多種抗真菌藥物有協(xié)同作用，并且已對小檗堿與氟康

4、唑的協(xié)同機制作了研究。咪康唑與小檗堿的協(xié)同作用研究，前期已做過體內(nèi)實驗，確定有效果，并且濃度已確定為：咪康唑1.5％，小檗堿1.5％聯(lián)合作用效果最好。
　　 本課題主要目的是研究小檗堿與咪康唑協(xié)同抗耐藥白念珠菌作用及作用機制。分為四大部分。
　　 第一部分，通過棋盤式微量稀釋法確定對咪康唑不敏感的白念珠菌及咪康唑與小檗堿聯(lián)合作用于白念珠菌的濃度，通過spotassay、生長曲線進一步驗證并摸索出后續(xù)研究中的最適濃度。實驗

5、選取白念珠菌18為研究對象，微量稀釋法測定MCZ2μM，BBR1μM時就有很好的協(xié)同作用，Spotaasay中聯(lián)合作用MCZ2μM時，BBR16μM以上協(xié)同作用效果較好，生長曲線結(jié)果表明，MCZ2Mμ，BBR64μM協(xié)同作用效果穩(wěn)定，故根據(jù)第一部分實驗結(jié)果，選取MCZ2μM，BBR64μM作用于白念珠菌18作后續(xù)研究。
　　 第二部分，通過實驗室前期已構建的平臺來研究兩藥協(xié)同作用，主要方法有，透射電鏡觀察藥物對白念珠菌超微結(jié)構的

6、影響，流式細胞儀測定細胞周期觀察藥物對細胞周期的影響，羅丹明外排實驗測定白念珠菌CDR1外排泵功能，GC-MS測定藥物作用下麥角甾醇含量的變化，用POLARstar多功能微板檢測儀檢測細胞內(nèi)活性氧(ROS)的產(chǎn)生量。
　　 超微結(jié)構觀察，高濃度咪康唑作用下的細胞形態(tài)變化較大，尤其是細胞壁部分，變薄消失得更明顯，并且有很多小核出現(xiàn)，出現(xiàn)空泡，而低濃度咪康唑與小檗堿聯(lián)合作用時細胞壁與單用藥類似，但不同的是，細胞中靠近細胞膜的地方有大

7、量不明物質(zhì)聚集，并且與細胞質(zhì)界線分明伴隨胞漿出現(xiàn)腫脹現(xiàn)象。細胞周期實驗中兩藥合用能引起細胞周期阻滯于S期，咪康唑高濃度組無該現(xiàn)象?；钚匝鯗y定實驗中，兩藥合用降低活性氧的產(chǎn)生量，但顯著多于空白對照組。麥角甾醇測定實驗中兩藥合用也能引起與咪康唑單用相同的羊毛甾醇累積，并且兩藥合用引起的羊毛甾醇累積多余咪康唑單用組，并有顯著差異。不同的是合用后麥角甾醇含量又所上升，但沒顯著差異。綜上實驗，本部分作如下解釋推測：咪康唑?qū)Π啄钪榫袣饔茫?/p>

8、念珠菌自身有一套保護機制，如耐藥蛋白對藥物的外排，部分白念株菌能被咪康唑殺傷，但有部分不能殺傷，甚至產(chǎn)生變異，從而對咪康唑耐藥性進一步加強，臨床上的超級耐藥菌產(chǎn)生的部分原理與此相同。小檗堿對白念珠菌有一定的保護作用，推測，兩藥聯(lián)合作用時，加入小檗堿表面上能減少咪康唑的直接殺傷損害真菌細胞的作用，但是卻增加真菌細胞不可逆轉(zhuǎn)的慢性損傷，使對真菌細胞的殺傷損害作用穩(wěn)定而持久，這也是兩藥聯(lián)合優(yōu)于咪康唑高濃度的優(yōu)勢之一。小檗堿與咪康唑兩藥聯(lián)合不僅

9、能降低高濃度咪康唑引起的毒性，而且二者的殺菌效果較高濃度咪康唑更有優(yōu)勢。
　　 第三部分，藥物體內(nèi)作用效果研究，主要是實驗室前期研究工作的后續(xù)，在前期已有工作基礎上，進行實驗重復驗證，并進一步通過病理切片觀察藥物對豚鼠感染皮膚的作用。雖然實驗后期豚鼠表面痊愈情況相差無幾，但是從病理切片結(jié)果來看，聯(lián)合用藥組可以殺滅豚鼠皮下組織中殘留的真菌，這可以很好的防止真菌感染后反復性發(fā)作。
　　 第四部分，主要是方法學研究，在測定活性

10、氧過程中發(fā)現(xiàn)一些存在問題，通過文獻調(diào)研，發(fā)現(xiàn)使用DCFH-DA測定細胞內(nèi)活性氧雖有很大優(yōu)勢，如簡便定量等，但其測定活性氧過程中受很多因素影響，文獻中已對光照、實驗時溶劑的pH值等做過研究，但鮮有人研究化合物對其作用的影響。而本實驗室測定活性氧的實驗有很大一部分是建立在在化合物作用下活性氧產(chǎn)生的改變量，并且文獻中也有此類應用，故第四部分主要研究化合物對染料測定熒光值得影響，研究證明，不同化合物對染料及染料水解后會有不同的影響。從文獻及實驗

11、結(jié)果來看，使用DCFH-DA作為測定活性氧染料需要有以下注意事項：
　　 1.實驗過程中須做好避光工作；
　　 2.染料需用乙醇溶解；
　　 3.溶劑酸堿性為中性或偏堿性時，染料孵育時間盡量縮短；
　　 4.一定要設置單純藥物與染料在溶劑中相互作用的對照組；
　　 5.染料對細胞本身有一定損害作用，故其濃度不能太高；
　　 6.測定過程中所顯示的熒光強度對溫度敏感，故實驗須在相同條件下進行