RTA2基因降低白念珠菌對氟康唑敏感性的機(jī)制研究.pdf

1、在白念珠菌（Candida albicans）中，由于越來越多的菌株對藥物產(chǎn)生了耐藥性，導(dǎo)致臨床上用于治療念珠菌感染的一線藥物氟康唑(Fluconazloe，F(xiàn)LC)的治療產(chǎn)生失敗。我們實(shí)驗室前期的研究發(fā)現(xiàn):在體外，RTA2基因編碼的蛋白參與了由白念珠菌鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶(calcineurin，CaN)信號通路介導(dǎo)的對氟康唑的耐藥。在本研究中，通過藥物敏感性實(shí)驗考察不同基因背景的RTA2基因相關(guān)菌株對氟康唑的敏感性差異，發(fā)現(xiàn):在野生型菌株

2、（cna△/△::CNA，crz1△/△:: CRZ1，rta2△/△::RTA2）中加入1mM CaCl2可以激活CaN信號通路，使菌株對唑類藥物氟康唑的敏感性顯著降低（最低抑菌濃度由0.5μg/ml升高為16μg/ml和64μg/ml）;加入1mM CaCl2激活CaN信號通路，RTA2基因缺失菌（rta2△/△，cna△/△::CNA; rta2△/△，crz1△/△:: CRZ1）和鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶CNA基因缺失菌（cna△/△，

3、rta2△/△::RTA2）以及CaN信號通路轉(zhuǎn)錄因子CRZ1基因缺失菌（crz1△/△，rta2△/△::RTA2）一樣，對氟康唑的敏感性無顯著變化。說明在體外鈣離子激活的CaN信號通路通過RTA2p降低白念珠菌對氟康唑的敏感性。通過透射電鏡實(shí)驗考察不同濃度的氟康唑?qū)Σ煌虮尘暗腞TA2基因相關(guān)菌株細(xì)胞膜超微結(jié)構(gòu)的影響，我們發(fā)現(xiàn):在體外，鈣離子激活鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶通路后，可以通過Rta2p來減弱氟康唑?qū)?xì)胞膜的損傷，從而顯著的降低了白

4、念珠菌對氟康唑的敏感性。此外，我們構(gòu)建了小鼠深部真菌感染模型，考察基因RTA2對模型動物生存時間及腎臟荷菌量的影響，發(fā)現(xiàn):RTA2基因本身并不能影響白念珠菌的毒力;但RTA2基因缺失后，感染小鼠接受氟康唑治療后，生存率顯著提高;相反，異位表達(dá)RTA2基因顯著的降低了氟康唑在宿主中對白念珠菌的療效。綜上所述，我們認(rèn)為在體內(nèi)體外鈣離子激活的鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶通路，通過Rta2p來降低白念珠菌對氟康唑的敏感性。
　　 在白念珠菌中，基因R

5、TA2是鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶通路調(diào)控的一個下游基因，但是其調(diào)控機(jī)制并不明確。本課題采用海腎熒光素酶報告基因(Renilla Luciferase，RLUC)系統(tǒng)進(jìn)行研究:將不同長度的RTA2基因啟動子片段連接到報告基因載體中，再將構(gòu)建好的載體分別轉(zhuǎn)入菌株DJY201（△/△cna，△/△rta2）、MJY201（△/△crz1，△/△rta2）、JXM101（△/△rta2）中，考察加入鈣離子前后熒光活性的變化倍數(shù)。進(jìn)一步證明RTA2基因是C

6、aN信號通路的靶基因，其表達(dá)水平受到轉(zhuǎn)錄因子Crzlp的調(diào)控;發(fā)現(xiàn)Crzlp的DNA結(jié)合序列—鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶依賴性應(yīng)答元件(calcineruin-dependent responseelement，CDRE)，可能位于RTA2基因啟動子上游-973bp～-920bp的區(qū)間內(nèi)，通過生物信息學(xué)分析推測其序列可能為GATGT。
　　 我們實(shí)驗室前期研究發(fā)現(xiàn):在臨床白念珠菌中，外源性加入1mMCaCl2激活CaN信號通路，可以不同程度

7、的上調(diào)RTA2基因的表達(dá)水平。通過小鼠深部真菌感染模型發(fā)現(xiàn)，鈣離子誘導(dǎo)的RTA2基因高表達(dá)的菌株感染的小鼠接受氟康唑治療后，牛存率顯著低于鈣離子誘導(dǎo)的RTA2基因非高表達(dá)的菌株感染的小鼠。本研究通過體外藥物敏感性實(shí)驗和實(shí)時定量(Real-Time)PCR實(shí)驗發(fā)現(xiàn):鈣離子誘導(dǎo)的菌株對氟康唑敏感性降低和RTA2基因的表達(dá)水平密切相關(guān)。在鈣離子誘導(dǎo)的RTA2基因高表達(dá)的臨床菌株0511522中，敲除了RTA2基因。通過體外藥物敏感性實(shí)驗發(fā)現(xiàn)，