姜黃素紅曲霉菌轉(zhuǎn)化產(chǎn)物抗腫瘤作用的研究.pdf

1、目的：利用紫紅紅曲霉菌對姜黃素進行生物轉(zhuǎn)化，研究轉(zhuǎn)化產(chǎn)物對腫瘤的抑制作用及其可能機理，為進一步篩選新型高效的姜黃素類抗腫瘤新藥奠定基礎(chǔ)。
　　方法：
　?。?）從紅曲米中分離紅曲霉菌，研究其產(chǎn)色素、淀粉酶、蛋白酶、酯化酶、酯解酶的能力，分析其用于姜黃素生物轉(zhuǎn)化的可行性。
　　（2）將活化的紅曲霉菌以10％接種到含1%姜黃素的固體發(fā)酵培養(yǎng)基中，30℃培養(yǎng)24h，后轉(zhuǎn)至28℃培養(yǎng)12h，再30℃恒溫培養(yǎng)7d進行姜黃素生物轉(zhuǎn)

2、化；不加姜黃素的紅曲霉菌培養(yǎng)物為菌體對照；培養(yǎng)基中加入1%姜黃素但不接種紅曲霉菌作為底物對照。乙酸乙酯提取后，薄層層析（展開劑為氯仿：甲醇：甲酸=96：2：0.1）對轉(zhuǎn)化產(chǎn)物進行分析鑒定。
　?。?）研究轉(zhuǎn)化總產(chǎn)物對DPPH自由基的清除能力。
　?。?）昆明種小鼠腋下接種1×107個小鼠H22肝癌細(xì)胞，即刻給予治療：姜黃素轉(zhuǎn)化產(chǎn)物組以高劑量（2g/kg·d）、中劑量（1g/kg·d）、低劑量（500mg/kg·d）；底物對照

3、組以高劑量（2g/kg·d）、中劑量（1g/kg·d）、低劑量（500mg/kg·d）的底物；菌體對照組以高劑量（2g/kg·d）、中劑量（1g/kg·d）、低劑量（500mg/kg·d）；環(huán)磷酰胺對照組（200mg/kg·d）；模型組和正常組給予0.9%NaCl0.5ml。常規(guī)飼養(yǎng)、治療，10d后禁食12h，摘眼球取血，脫頸處死，剝?nèi)∧[瘤、稱重，計算抑瘤率；取肝臟、胸腺、脾臟稱重，計算臟器指數(shù)；分離血清，測定MDA、SOD、GSH-P

4、X、TNF-α、IL-2；取肝臟勻漿后，測定MDA、SOD、GSH-PX。
　　結(jié)果：
　?。?）本文分離獲得的紅曲霉菌，能產(chǎn)生色素，具有糖化淀粉酶、蛋白酶、酯化酶、酯解酶活性，可以用于姜黃素的轉(zhuǎn)化研究。
　?。?）利用該菌對姜黃素進行固體發(fā)酵微生物轉(zhuǎn)化，乙酸乙酯提取培養(yǎng)物，TLC結(jié)果顯示紅曲霉菌和姜黃素共培養(yǎng)物出現(xiàn)了能產(chǎn)生熒光的新斑點，比移值分別為0.133和0.192，姜黃素標(biāo)準(zhǔn)品的比移值為0.367。未加菌的姜黃

5、素培養(yǎng)物與姜黃素標(biāo)準(zhǔn)品展開斑點基本一致，說明轉(zhuǎn)化過程不存在非微生物引起的藥物分解產(chǎn)物。將紅曲菌培養(yǎng)物與姜黃素標(biāo)準(zhǔn)品在同一點點樣，展開后，沒有上述產(chǎn)熒光的斑點，說明新斑點并非在TLC展開過程中由于紅曲菌培養(yǎng)物和姜黃素互相干擾遷移而形成的。
　?。?）姜黃素轉(zhuǎn)化總產(chǎn)物在10000-400μg/ml(相當(dāng)于含姜黃素100-4μg/ml)濃度范圍內(nèi)有很強的自由基清除能力，100μg/ml（相當(dāng)于含姜黃素1μg/ml）還保留了47.46%的

6、清除能力；而底物對照物在10000μg/ml（相當(dāng)于含姜黃素100μg/ml）、2000μg/ml（含姜黃素20μg/ml）時有一定的清除能力，但400μg/ml（含姜黃素4μg/ml）濃度時自由基清除能力已明顯減弱，100μg/ml（含姜黃素1μg/ml）以下已基本消失。
　　（4）姜黃素轉(zhuǎn)化產(chǎn)物高、中、低劑量組的抑瘤作用分別為：37.08%、48.91%、26.55%，明顯高于同劑量的菌體對照組（6.39%、5.76%、5.2

7、9%）和底物對照組（19.57%、16.11%、11.61%）。姜黃素轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的各劑量組的抑瘤作用并沒有環(huán)磷酰胺對照組的強。
　?。?）小鼠胸腺指數(shù)、脾臟指數(shù)、肝臟指數(shù)的結(jié)果顯示轉(zhuǎn)化產(chǎn)物各劑量組均高于腫瘤模型組，而菌體對照組、底物對照組則與腫瘤模型組比較沒有明顯差異（p>0.05）。說明姜黃素轉(zhuǎn)化產(chǎn)物組能夠提高機體主要免疫器官的臟器指數(shù)，而菌體對照及底物對照的作用則不明顯。
　?。?）姜黃素轉(zhuǎn)化產(chǎn)物高、中、低劑量組血清TNF

8、-α（106.04±12.10pg/ml、97.25±18.21pg/ml、88.13±6.95pg/ml）、IL-2水平（19.47±2.90pg/ml、17.94±2.28pg/ml、14.87±2.65pg/ml）均高于腫瘤模型組，其與菌體對照組（TNF-α：74.40±8.70pg/ml、IL-2：11.79±1.83pg/ml）、底物對照組（TNF-α：72.86±14.37pg/ml、IL-2：11.85±2.47pg/ml

9、）比較，均高于菌體對照組及底物對照組，有明顯的差異（p<0.05）。說明姜黃素轉(zhuǎn)化產(chǎn)物可能是通過提高體內(nèi)TNF-α水平來直接殺傷腫瘤或者提高IL-2水平增強T細(xì)胞免疫應(yīng)答來抑制腫瘤生長的。
　　（7）姜黃素轉(zhuǎn)化產(chǎn)物高、中、低劑量組血清MDA含量分別為：2.81±0.65nmol/ml、3.75±1.62nmol/ml、4.75±1.62nmol/ml，肝臟MDA含量分別為：1.20±0.30nmol/ml、1.08±0.36nmo

10、l/ml、1.20±0.34nmol/ml，與腫瘤模型組比較，其血清和肝臟的過氧化脂質(zhì)的含量顯著降低（p<0.05）；而菌體對照組和底物對照各劑量組作用則不明顯（p>0.05）。
　?。?）姜黃素轉(zhuǎn)化產(chǎn)物高、中、低劑量組血清中超氧化物歧化酶的含量分別為：19.26±1.01U/ml、19.51±0.47U/ml、18.63±1.10U/ml，肝臟中分別為：21.33±0.36U/ml、21.21±0.78U/ml、21.77±0.

11、38U/ml。姜黃素轉(zhuǎn)化產(chǎn)物高、中、低劑量組血清中谷胱甘肽過氧化物酶的含量分別為：59.32±2.50U/L、59.18±5.18U/L l、56.90±6.29U/L，肝臟中的分別為：55.32±2.50U/L、55.18±3.26U/L、56.20±2.29U/L。姜黃素轉(zhuǎn)化產(chǎn)物各劑量組血清、肝臟中超氧化物歧化酶、谷胱甘肽過氧化物酶的含量低于正常組，與腫瘤模型組、菌體對照組、底物對照組比較沒有差異（p>0.05）。姜黃素轉(zhuǎn)化產(chǎn)物對此

12、二酶作用不明顯，說明其抗氧化作用可能并非通過改變此二酶活性來實現(xiàn)的。
　　結(jié)論：
　?。?）紫紅紅曲霉菌能產(chǎn)生多種酶系，是理想的生物轉(zhuǎn)化體系，利用該菌轉(zhuǎn)化姜黃素，可形成極性降低的新化合物群。
　?。?）體外實驗顯示姜黃素新組合型天然化合物群具有較強的DPPH自由基清除能力。
　　（3）體內(nèi)試驗顯示姜黃素新組合型天然化合物群對荷瘤小鼠的腫瘤有明顯的抑制作用。
　?。?）能夠增加機體主要免疫器官的臟器指數(shù)，提高