白藜蘆醇增強(qiáng)姜黃素對(duì)Raji細(xì)胞抗腫瘤作用的機(jī)制研究.pdf

1、背景與目的:
　　 淋巴瘤是起源于淋巴結(jié)和淋巴組織的免疫系統(tǒng)惡性腫瘤，是最早發(fā)現(xiàn)的血液系統(tǒng)惡性腫瘤之一。我國淋巴瘤死亡率為1.5/10萬，其中非霍奇金淋巴瘤(nonHodgkin lymphoma，NHL)占90％左右。NHL病死率高，化療副作用大。因此新型的低副作用的抗腫瘤藥日漸受到人們關(guān)注。
　　 熱休克蛋白(heat shock proteins，HSPs)是1962年發(fā)現(xiàn)的一種高度保守的胞漿蛋白質(zhì)家族。隨后人們又

2、發(fā)現(xiàn)HSPs可以作為分子伴侶(molecular chaperone)穩(wěn)定其他細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能，從而發(fā)揮有效的保護(hù)細(xì)胞的作用，這些被保護(hù)的蛋白稱為客戶蛋白(client proteins)。哺乳動(dòng)物體內(nèi)的HSPs可根據(jù)其分子量大小分為5個(gè)家族：Hsp100，Hsp90，Hsp70，Hsp60及小分子HSPs。熱休克蛋白作為分子伴侶的多種活性能保護(hù)腫瘤細(xì)胞中的各種蛋白，特別是參與調(diào)節(jié)細(xì)胞周期的蛋白，激酶蛋白，以及其他影響腫瘤細(xì)胞生

3、長的蛋白。
　　 隨著對(duì)惡性腫瘤的發(fā)生，進(jìn)展及轉(zhuǎn)移過程中的分子，遺傳及生化改變的了解，人們逐漸將藥物研究的重點(diǎn)從經(jīng)驗(yàn)性治療轉(zhuǎn)移到針對(duì)惡性腫瘤表型的分子靶向治療。惡性腫瘤具有遺傳性不穩(wěn)定的特點(diǎn)，也稱為遺傳多態(tài)性，這種特性讓腫瘤細(xì)胞很容易逃逸單一的分子靶向治療。細(xì)胞的生長發(fā)育過程中的信號(hào)傳導(dǎo)系統(tǒng)是一個(gè)復(fù)雜的，相互聯(lián)系的網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)，因此，僅僅針對(duì)一兩個(gè)蛋白分子的治療并不能改變多數(shù)腫瘤細(xì)胞的活性。如果能夠干涉某個(gè)能影響多個(gè)信號(hào)通路的蛋白質(zhì)

4、靶點(diǎn)，則可能極大的提高腫瘤的治療效能。Hsp90和Hsp70有多種客戶蛋白，對(duì)熱休克蛋白抑制則是一種針對(duì)多個(gè)靶點(diǎn)的分子靶向治療，這能影響腫瘤細(xì)胞增生的信號(hào)通路中的多個(gè)蛋白，也是近年來研究的熱點(diǎn)。
　　 姜黃素(curcumin，Cur)是中藥姜黃中提取的酚性色素，具有抗氧化、抗腫瘤、抗炎等廣泛的藥理作用。已有實(shí)驗(yàn)研究表明姜黃素能明顯誘導(dǎo)非霍奇金淋巴瘤細(xì)胞系Raji細(xì)胞凋亡。我們?cè)缙诘膶?shí)驗(yàn)研究表明姜黃素誘導(dǎo)凋亡的機(jī)制可能是作為去乙

5、?；敢种苿?histone deacetylase inhibitor，HDACI)抑制Raii細(xì)胞中Ⅱ類去乙?；?histone deacetylase，HDAC)HDAC6的表達(dá)，從而促進(jìn)Hsp90的乙?；绊慔sp90的分子伴侶功能，并且通過影響Hsp90下游的多種客戶蛋白實(shí)現(xiàn)抗腫瘤作用，這可能是姜黃素對(duì)腫瘤細(xì)胞有多個(gè)作用靶點(diǎn)的原因。近來的研究發(fā)現(xiàn)，多種HDACI及HSP90抑制劑(如LAQ824，17AAG，17-DMAG

6、，IPI504等)在抑制Hsp90功能的同時(shí)，都能觀察到Hsp70蛋白的表達(dá)增加。而姜黃素作為新一代的HDACI，是否也能導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞中Hsp70表達(dá)量的增加尚未見報(bào)道。
　　 白藜蘆醇(resveratrol，Res)是從多種葡萄屬植物中提取的多酚類化合物，具有抗炎，抗菌，抗腫瘤等作用。白藜蘆醇能通過多種途徑抑制腫瘤細(xì)胞的發(fā)生和發(fā)展。Prabir K等最近發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇能誘導(dǎo)K562細(xì)胞凋亡，其主要機(jī)制是通過抑制HSF1的轉(zhuǎn)錄活

7、性下調(diào)Hsp70的表達(dá)。我們前期的實(shí)驗(yàn)研究也表明白藜蘆醇能從基因和蛋白水平降低Raji細(xì)胞中Hsp70的表達(dá)，并能誘導(dǎo)Raji細(xì)胞凋亡。
　　 當(dāng)細(xì)胞內(nèi)Hsp90的功能受到抑制時(shí)，Hsp70能“替補(bǔ)”Hsp90的功能，繼續(xù)發(fā)揮保護(hù)客戶蛋白的作用，維持細(xì)胞穩(wěn)定，使腫瘤細(xì)胞免于凋亡。姜黃素如存在誘導(dǎo)Hsp70表達(dá)的作用，就可能會(huì)影響其最終的抗腫瘤效能，為此我們觀察了姜黃素在抑制Raji細(xì)胞的Hsp90伴侶功能的同時(shí)，是否導(dǎo)致了Hsp

8、70表達(dá)的增加，如果的確存在類似現(xiàn)象，再將前期試驗(yàn)中證實(shí)的對(duì)Hsp70有抑制作用的白藜蘆醇與姜黃素聯(lián)合用藥，觀察聯(lián)合用藥與各自單獨(dú)用藥在Raji細(xì)胞中對(duì)Hsp70表達(dá)量的影響及最后的促凋亡效果，初步探討其潛在的機(jī)制，為中藥的聯(lián)合應(yīng)用提高抗腫瘤效能提供新思路。
　　 實(shí)驗(yàn)材料與方法：
　　 1.細(xì)胞來源及培養(yǎng)
　　 人非霍奇金淋巴瘤細(xì)胞系Raji細(xì)胞購自上海生命科學(xué)院細(xì)胞庫。體外培養(yǎng)Raji細(xì)胞，取對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞做

9、實(shí)驗(yàn)。
　　 2.實(shí)驗(yàn)方法
　　 ①不同濃度的白藜蘆醇和姜黃素與Raji細(xì)胞共培養(yǎng)，光學(xué)顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)變化。
　　 ②Western-blot及RT-PCR法檢測(cè)不同藥物濃度和處理時(shí)間前后Raji細(xì)胞中Hsp70或Hsp90的蛋白和mRNA表達(dá)水平。
　　 ③CCK8法檢測(cè)用藥前后Raji細(xì)胞的增生抑制情況。
　　 ④流式細(xì)胞儀檢測(cè)用藥前后Raji細(xì)胞的凋亡情況。
　　 3.統(tǒng)計(jì)分析<

10、br>　　 計(jì)量資料的描述用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)。多組的計(jì)量資料比較采用方差分析，組間比較采用LSD-t檢驗(yàn)；兩組間比較采用成組設(shè)計(jì)的t檢驗(yàn)。所有數(shù)據(jù)均應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件處理，檢驗(yàn)水準(zhǔn)定為P≤0.05差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)果：
　　 1.姜黃素對(duì)Raji細(xì)胞中Hsp70蛋白表達(dá)的影響。與對(duì)照組相比，姜黃素25μmol/L處理Raji細(xì)胞12h、24h、36h后Hsp70的表達(dá)有所增加，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意

11、義(P=0.411)，兩兩比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。與對(duì)照組相比，姜黃素50μmol/L處理Raji細(xì)胞12h、24h、36h后Hsp70的表達(dá)逐漸增加，統(tǒng)計(jì)分析示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.014)，兩兩比較顯示，姜黃素50μmol/L處理后36h與0h、12h、24h相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　 2.姜黃素對(duì)Raji細(xì)胞中Hsp70 mRNA表達(dá)的影響。與對(duì)照組相比，姜黃素50μmol/L處理Ra

12、ji細(xì)胞12h、24h、36h后Rjii細(xì)胞中Hsp70的mRNA表達(dá)水平明顯上升。統(tǒng)計(jì)分析示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.001)，兩兩比較示白藜蘆醇處理后24h、36h與對(duì)照組之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　 3.白藜蘆醇對(duì)Raji細(xì)胞中Hsp90蛋白表達(dá)的影響。與對(duì)照組相比，白藜蘆醇100μmol/L處理Raji細(xì)胞24h，48h，72h后Raji細(xì)胞中Hsp90的表達(dá)水平逐漸下降。統(tǒng)計(jì)分析示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=

13、0.001)，兩兩比較示白藜蘆醇處理后48h、72h與對(duì)照組之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　 4.白藜蘆醇對(duì)Raji細(xì)胞中Hsp90mRNA表達(dá)的影響。與對(duì)照組相比，白藜蘆醇100μmol/L處理Raji細(xì)胞24h、48h、72h后Raji細(xì)胞中Hsp90的mRNA表達(dá)水平逐漸下降。統(tǒng)計(jì)分析示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.000)，兩兩比較示白藜蘆醇處理后0h與24h、48h、72h之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。

14、
　　 5.比較白藜蘆醇100μmol/L與姜黃素50μmol/L聯(lián)合用藥及各自單獨(dú)用藥后48hRaii細(xì)胞中Hsp70的蛋白表達(dá)情況，姜黃素單獨(dú)用藥組比聯(lián)合用藥組、對(duì)照組、白藜蘆醇單獨(dú)用藥組Hsp70表達(dá)水平高，統(tǒng)計(jì)分析示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　 6.姜黃素與白藜蘆醇聯(lián)合用藥及各自單獨(dú)用藥48h后Raji細(xì)胞的增生抑制情況。姜黃素與白藜蘆醇單獨(dú)用藥均能有效抑制Raji細(xì)胞的增生，以姜黃素更為明顯，聯(lián)合用

15、藥后抑制作用最強(qiáng)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，兩兩比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。姜黃素與白藜蘆醇兩藥的相互作用指數(shù)γ＜1。
　　 7.姜黃素與白藜蘆醇不同的順序用藥對(duì)Raji細(xì)胞中Hsp70蛋白表達(dá)的影響。實(shí)驗(yàn)分四組：分別為空白對(duì)照組(Control)即無藥物細(xì)胞培養(yǎng)48小時(shí)；姜黃素50μmol/L用藥24h后洗脫，白藜蘆醇100μmol/L繼續(xù)用藥24h(Cur→Res)；白藜蘆醇100μmol/L用藥24h后

16、洗脫，姜黃素50μmol/L繼續(xù)用藥24h(Res→Cur)；將已處對(duì)數(shù)生長24小時(shí)的細(xì)胞加入白藜蘆醇100μmol/L和姜黃素50μmol/L同時(shí)處理24h(Res+Cur)。結(jié)果示Cur→Res組Hsp70表達(dá)量比其余各組高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，其余各組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。
　　 8.流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡。分組同上一步實(shí)驗(yàn)。三組處理組均能誘導(dǎo)Raji細(xì)胞凋亡，以Res→Cur組最為明顯，Res

17、+Cur組次之。統(tǒng)計(jì)分析示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.012)。結(jié)論
　　 1.姜黃素能誘導(dǎo)Raji細(xì)胞中Hsp70蛋白和mRNA的表達(dá)。
　　 2.白藜蘆醇不僅能抑制Raji細(xì)胞中Hsp70蛋白和mRNA表達(dá)，還能抑制Raji細(xì)胞中Hsp90蛋白和mRNA的表達(dá)。
　　 3.白藜蘆醇與姜黃素聯(lián)合用藥比姜黃素單獨(dú)用藥后Raji細(xì)胞中Hsp70的表達(dá)量低，白藜蘆醇能拮抗姜黃素誘導(dǎo)產(chǎn)生Hsp70。
　　 4.白

18、藜蘆醇與姜黃素聯(lián)合用藥比各自單獨(dú)用藥更能抑制Raji細(xì)胞增生，兩藥之間相互作用為協(xié)同作用。
　　 5.白藜蘆醇不能抑制姜黃素已經(jīng)誘導(dǎo)產(chǎn)生的Hsp70，而當(dāng)白藜蘆醇用在姜黃素之前或與姜黃素同時(shí)用藥時(shí)，能拮抗姜黃素對(duì)Hsp70的誘導(dǎo)。
　　 6.不同的用藥順序?qū)aji細(xì)胞誘導(dǎo)凋亡的作用不同，先用白藜蘆醇再用姜黃素比相反的用藥順序及兩者同時(shí)用藥更能誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，兩者同時(shí)用藥比先用姜黃素再用白藜蘆醇誘導(dǎo)Raji細(xì)胞凋亡更明顯。