白藜蘆醇增強姜黃素對Raji細胞抗腫瘤作用的機制研究.pdf

1、背景與目的:
　　 淋巴瘤是起源于淋巴結(jié)和淋巴組織的免疫系統(tǒng)惡性腫瘤，是最早發(fā)現(xiàn)的血液系統(tǒng)惡性腫瘤之一。我國淋巴瘤死亡率為1.5/10萬，其中非霍奇金淋巴瘤(nonHodgkin lymphoma，NHL)占90％左右。NHL病死率高，化療副作用大。因此新型的低副作用的抗腫瘤藥日漸受到人們關(guān)注。
　　 熱休克蛋白(heat shock proteins，HSPs)是1962年發(fā)現(xiàn)的一種高度保守的胞漿蛋白質(zhì)家族。隨后人們又

2、發(fā)現(xiàn)HSPs可以作為分子伴侶(molecular chaperone)穩(wěn)定其他細胞內(nèi)蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能，從而發(fā)揮有效的保護細胞的作用，這些被保護的蛋白稱為客戶蛋白(client proteins)。哺乳動物體內(nèi)的HSPs可根據(jù)其分子量大小分為5個家族：Hsp100，Hsp90，Hsp70，Hsp60及小分子HSPs。熱休克蛋白作為分子伴侶的多種活性能保護腫瘤細胞中的各種蛋白，特別是參與調(diào)節(jié)細胞周期的蛋白，激酶蛋白，以及其他影響腫瘤細胞生

3、長的蛋白。
　　 隨著對惡性腫瘤的發(fā)生，進展及轉(zhuǎn)移過程中的分子，遺傳及生化改變的了解，人們逐漸將藥物研究的重點從經(jīng)驗性治療轉(zhuǎn)移到針對惡性腫瘤表型的分子靶向治療。惡性腫瘤具有遺傳性不穩(wěn)定的特點，也稱為遺傳多態(tài)性，這種特性讓腫瘤細胞很容易逃逸單一的分子靶向治療。細胞的生長發(fā)育過程中的信號傳導系統(tǒng)是一個復雜的，相互聯(lián)系的網(wǎng)絡系統(tǒng)，因此，僅僅針對一兩個蛋白分子的治療并不能改變多數(shù)腫瘤細胞的活性。如果能夠干涉某個能影響多個信號通路的蛋白質(zhì)

4、靶點，則可能極大的提高腫瘤的治療效能。Hsp90和Hsp70有多種客戶蛋白，對熱休克蛋白抑制則是一種針對多個靶點的分子靶向治療，這能影響腫瘤細胞增生的信號通路中的多個蛋白，也是近年來研究的熱點。
　　 姜黃素(curcumin，Cur)是中藥姜黃中提取的酚性色素，具有抗氧化、抗腫瘤、抗炎等廣泛的藥理作用。已有實驗研究表明姜黃素能明顯誘導非霍奇金淋巴瘤細胞系Raji細胞凋亡。我們早期的實驗研究表明姜黃素誘導凋亡的機制可能是作為去乙

5、?；敢种苿?histone deacetylase inhibitor，HDACI)抑制Raii細胞中Ⅱ類去乙?；?histone deacetylase，HDAC)HDAC6的表達，從而促進Hsp90的乙?；?，影響Hsp90的分子伴侶功能，并且通過影響Hsp90下游的多種客戶蛋白實現(xiàn)抗腫瘤作用，這可能是姜黃素對腫瘤細胞有多個作用靶點的原因。近來的研究發(fā)現(xiàn)，多種HDACI及HSP90抑制劑(如LAQ824，17AAG，17-DMAG

6、，IPI504等)在抑制Hsp90功能的同時，都能觀察到Hsp70蛋白的表達增加。而姜黃素作為新一代的HDACI，是否也能導致腫瘤細胞中Hsp70表達量的增加尚未見報道。
　　 白藜蘆醇(resveratrol，Res)是從多種葡萄屬植物中提取的多酚類化合物，具有抗炎，抗菌，抗腫瘤等作用。白藜蘆醇能通過多種途徑抑制腫瘤細胞的發(fā)生和發(fā)展。Prabir K等最近發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇能誘導K562細胞凋亡，其主要機制是通過抑制HSF1的轉(zhuǎn)錄活

7、性下調(diào)Hsp70的表達。我們前期的實驗研究也表明白藜蘆醇能從基因和蛋白水平降低Raji細胞中Hsp70的表達，并能誘導Raji細胞凋亡。
　　 當細胞內(nèi)Hsp90的功能受到抑制時，Hsp70能“替補”Hsp90的功能，繼續(xù)發(fā)揮保護客戶蛋白的作用，維持細胞穩(wěn)定，使腫瘤細胞免于凋亡。姜黃素如存在誘導Hsp70表達的作用，就可能會影響其最終的抗腫瘤效能，為此我們觀察了姜黃素在抑制Raji細胞的Hsp90伴侶功能的同時，是否導致了Hsp

8、70表達的增加，如果的確存在類似現(xiàn)象，再將前期試驗中證實的對Hsp70有抑制作用的白藜蘆醇與姜黃素聯(lián)合用藥，觀察聯(lián)合用藥與各自單獨用藥在Raji細胞中對Hsp70表達量的影響及最后的促凋亡效果，初步探討其潛在的機制，為中藥的聯(lián)合應用提高抗腫瘤效能提供新思路。
　　 實驗材料與方法：
　　 1.細胞來源及培養(yǎng)
　　 人非霍奇金淋巴瘤細胞系Raji細胞購自上海生命科學院細胞庫。體外培養(yǎng)Raji細胞，取對數(shù)生長期細胞做

9、實驗。
　　 2.實驗方法
　　 ①不同濃度的白藜蘆醇和姜黃素與Raji細胞共培養(yǎng)，光學顯微鏡觀察細胞形態(tài)變化。
　　 ②Western-blot及RT-PCR法檢測不同藥物濃度和處理時間前后Raji細胞中Hsp70或Hsp90的蛋白和mRNA表達水平。
　　 ③CCK8法檢測用藥前后Raji細胞的增生抑制情況。
　　 ④流式細胞儀檢測用藥前后Raji細胞的凋亡情況。
　　 3.統(tǒng)計分析<

10、br>　　 計量資料的描述用均數(shù)±標準差(x±s)。多組的計量資料比較采用方差分析，組間比較采用LSD-t檢驗；兩組間比較采用成組設計的t檢驗。所有數(shù)據(jù)均應用SPSS13.0統(tǒng)計軟件處理，檢驗水準定為P≤0.05差異有統(tǒng)計學意義。
　　 結(jié)果：
　　 1.姜黃素對Raji細胞中Hsp70蛋白表達的影響。與對照組相比，姜黃素25μmol/L處理Raji細胞12h、24h、36h后Hsp70的表達有所增加，但差異無統(tǒng)計學意

11、義(P=0.411)，兩兩比較差異均無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。與對照組相比，姜黃素50μmol/L處理Raji細胞12h、24h、36h后Hsp70的表達逐漸增加，統(tǒng)計分析示差異有統(tǒng)計學意義(P=0.014)，兩兩比較顯示，姜黃素50μmol/L處理后36h與0h、12h、24h相比差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。
　　 2.姜黃素對Raji細胞中Hsp70 mRNA表達的影響。與對照組相比，姜黃素50μmol/L處理Ra

12、ji細胞12h、24h、36h后Rjii細胞中Hsp70的mRNA表達水平明顯上升。統(tǒng)計分析示差異有統(tǒng)計學意義(P=0.001)，兩兩比較示白藜蘆醇處理后24h、36h與對照組之間差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。
　　 3.白藜蘆醇對Raji細胞中Hsp90蛋白表達的影響。與對照組相比，白藜蘆醇100μmol/L處理Raji細胞24h，48h，72h后Raji細胞中Hsp90的表達水平逐漸下降。統(tǒng)計分析示差異有統(tǒng)計學意義(P=

13、0.001)，兩兩比較示白藜蘆醇處理后48h、72h與對照組之間差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。
　　 4.白藜蘆醇對Raji細胞中Hsp90mRNA表達的影響。與對照組相比，白藜蘆醇100μmol/L處理Raji細胞24h、48h、72h后Raji細胞中Hsp90的mRNA表達水平逐漸下降。統(tǒng)計分析示差異有統(tǒng)計學意義(P=0.000)，兩兩比較示白藜蘆醇處理后0h與24h、48h、72h之間差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。

14、
　　 5.比較白藜蘆醇100μmol/L與姜黃素50μmol/L聯(lián)合用藥及各自單獨用藥后48hRaii細胞中Hsp70的蛋白表達情況，姜黃素單獨用藥組比聯(lián)合用藥組、對照組、白藜蘆醇單獨用藥組Hsp70表達水平高，統(tǒng)計分析示差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。
　　 6.姜黃素與白藜蘆醇聯(lián)合用藥及各自單獨用藥48h后Raji細胞的增生抑制情況。姜黃素與白藜蘆醇單獨用藥均能有效抑制Raji細胞的增生，以姜黃素更為明顯，聯(lián)合用

15、藥后抑制作用最強，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，兩兩比較差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。姜黃素與白藜蘆醇兩藥的相互作用指數(shù)γ＜1。
　　 7.姜黃素與白藜蘆醇不同的順序用藥對Raji細胞中Hsp70蛋白表達的影響。實驗分四組：分別為空白對照組(Control)即無藥物細胞培養(yǎng)48小時；姜黃素50μmol/L用藥24h后洗脫，白藜蘆醇100μmol/L繼續(xù)用藥24h(Cur→Res)；白藜蘆醇100μmol/L用藥24h后

16、洗脫，姜黃素50μmol/L繼續(xù)用藥24h(Res→Cur)；將已處對數(shù)生長24小時的細胞加入白藜蘆醇100μmol/L和姜黃素50μmol/L同時處理24h(Res+Cur)。結(jié)果示Cur→Res組Hsp70表達量比其余各組高，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，其余各組間差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。
　　 8.流式細胞儀檢測細胞凋亡。分組同上一步實驗。三組處理組均能誘導Raji細胞凋亡，以Res→Cur組最為明顯，Res

17、+Cur組次之。統(tǒng)計分析示差異有統(tǒng)計學意義(P=0.012)。結(jié)論
　　 1.姜黃素能誘導Raji細胞中Hsp70蛋白和mRNA的表達。
　　 2.白藜蘆醇不僅能抑制Raji細胞中Hsp70蛋白和mRNA表達，還能抑制Raji細胞中Hsp90蛋白和mRNA的表達。
　　 3.白藜蘆醇與姜黃素聯(lián)合用藥比姜黃素單獨用藥后Raji細胞中Hsp70的表達量低，白藜蘆醇能拮抗姜黃素誘導產(chǎn)生Hsp70。
　　 4.白

18、藜蘆醇與姜黃素聯(lián)合用藥比各自單獨用藥更能抑制Raji細胞增生，兩藥之間相互作用為協(xié)同作用。
　　 5.白藜蘆醇不能抑制姜黃素已經(jīng)誘導產(chǎn)生的Hsp70，而當白藜蘆醇用在姜黃素之前或與姜黃素同時用藥時，能拮抗姜黃素對Hsp70的誘導。
　　 6.不同的用藥順序?qū)aji細胞誘導凋亡的作用不同，先用白藜蘆醇再用姜黃素比相反的用藥順序及兩者同時用藥更能誘導細胞凋亡，兩者同時用藥比先用姜黃素再用白藜蘆醇誘導Raji細胞凋亡更明顯。