IL-37調(diào)節(jié)巨噬細胞極化抑制宿主肝臟血吸蟲蟲卵肉芽腫和纖維化的機制研究.pdf

1、血吸蟲?。⊿chistosomiasis）是一種嚴重危害流行區(qū)人民健康和阻礙社會經(jīng)濟發(fā)展的熱帶病。該病主要分布于亞洲、非洲及拉丁美洲的76個國家和地區(qū)，患病人數(shù)達2億以上。血吸蟲病也是威脅我國人民健康的重要寄生蟲病，截至2015年底，據(jù)推算全國共約有7.7萬血吸蟲病人。雖然監(jiān)測資料顯示全國血吸蟲病疫情有下降趨勢，但血吸蟲病流行環(huán)節(jié)復(fù)雜、影響因素眾多，我國血吸蟲病防治工作仍面臨諸多嚴峻挑戰(zhàn)。因此，有效預(yù)防和治療血吸蟲病仍是當前研究的熱點和

2、難點。
　　血吸蟲病的主要危害是蟲卵肉芽腫病變和繼發(fā)性肝纖維化。巨噬細胞(Macrophage，M)是肉芽腫組織的主要細胞成分，也是固有免疫的重要成分，同時還作為抗原遞呈細胞啟動并調(diào)節(jié)獲得性免疫應(yīng)答，在蟲卵肉芽腫及纖維化形成和發(fā)展中發(fā)揮關(guān)鍵作用。雖然血吸蟲蟲卵肉芽腫的形成由嗜酸性粒細胞、中性粒細胞、淋巴細胞和肝星狀細胞等的共同參與，但是巨噬細胞發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用，巨噬細胞的極化狀態(tài)顯著影響肝臟蟲卵肉芽腫和纖維化的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)歸

3、，從而顯著影響血吸蟲感染后對宿主的致病及其后果。尤其M2型巨噬細胞對宿主度過血吸蟲病急性期至關(guān)重要，若能早期抑制M1型巨噬細胞的過度活化使其盡早向M2型極化，阻止炎癥重癥化，或可為臨床干預(yù)免疫炎癥導(dǎo)致肝纖維化的發(fā)生發(fā)展提供新的靶點和依據(jù)。
　　控制血吸蟲病患者的炎癥反應(yīng)和適度抑制蟲卵肉芽腫的形成，巨噬細胞正是一個理想的靶向目標。已有研究提示，巨噬細胞的極化過程是可逆的，巨噬細胞的表型和功能的改變可能受局部一些細胞因子環(huán)境調(diào)控。只是

4、目前在蟲卵肉芽腫和纖維化發(fā)生發(fā)展的不同時期，到底是哪些因素觸發(fā)巨噬細胞的表型和功能發(fā)生變化，尚未見系統(tǒng)深入的研究。全面了解血吸蟲蟲卵肉芽腫和纖維化發(fā)生發(fā)展中巨噬細胞的表型及功能改變原因，早期抑制 M1型巨噬細胞的過度活化并/或使其盡早向M2型極化，阻止炎癥重癥化，將為減輕或抑制肉芽腫炎癥反應(yīng)和肝纖維化提供新的思路。
　　白細胞介素-37（Interleukin-37，IL-37）是IL-1家族的新成員，又被稱為IL-1F7。IL-

5、37是近年來發(fā)現(xiàn)的一種能夠調(diào)節(jié)固有免疫和獲得性免疫應(yīng)答的細胞因子，在各種炎性疾病和免疫性疾病中具有抑制炎癥作用。IL-37在可多種細胞中表達，主要表達于巨噬細胞、淋巴細胞、單核細胞、組織上皮細胞、滑膜細胞、間質(zhì)細胞、腺細胞、角質(zhì)形成細胞和樹突狀細胞等。成熟的IL-37可分泌到細胞外與細胞表面SIGIRR和IL-18Rα兩個受體亞基結(jié)合通過受體途徑進行免疫負調(diào)控作用；另外成熟的IL-37還可進入A549細胞和THP-1細胞的細胞核，與Sm

6、ad3蛋白相互作用，通過核轉(zhuǎn)錄因子途徑抑制免疫應(yīng)答。以往研究表明IL-37對巨噬細胞具有免疫調(diào)節(jié)作用，但IL-37是否影響巨噬細胞的極化以及作用機制目前尚未報道。
　　我們推測在血吸蟲感染時，IL-37可能抑制M0極化為M1型巨噬細胞并介導(dǎo)M0較早向M2極化，從而抑制或減輕蟲卵肉芽腫引起的宿主過度的炎癥反應(yīng)，使宿主順利度過血吸蟲感染急性期反應(yīng)并減輕后期肝纖維化的發(fā)生和發(fā)展。
　　由于市售的IL-37細胞因子的設(shè)計沒有體現(xiàn)其轉(zhuǎn)

7、錄因子的作用，該細胞因子的成藥性可能被低估，而且不能從轉(zhuǎn)錄因子角度研究IL-37。為了深入研究IL-37如何抑制宿主血吸蟲肝纖維化的作用及其機制，本課題組主要成員美國Antagen制藥有限公司研發(fā)總監(jiān)及我校兼職教授高聞達自主設(shè)計并制備了轉(zhuǎn)染人CPP-IgG2Fc-IL-37的CHO細胞株和no CPP-IgG2Fc-IL-37的CHO細胞株。通過該兩株細胞的培養(yǎng)，得到并純化出真核細胞表達的 CPP-IgG2Fc-IL-37和 no CP

8、P-IgG2Fc-IL-37蛋白。其中 hIL-37為人 IL-37蛋白；CPP為細胞穿透肽（cell-penetrating peptide，CPP），有助于蛋白進入細胞內(nèi)發(fā)揮作用；帶有IgG2Fc mut是為了避免產(chǎn)生ADCC或者CDC，延長IL-37蛋白的體內(nèi)半衰期并有利于蛋白純化；同時還在CPP-IL-37和IgG2Fc之間設(shè)計了帶有WEHD氨基酸序列的caspase-1酶切位點。這樣CPP-IgG2Fc-IL-37蛋白可從細胞

9、外通過CPP的作用轉(zhuǎn)導(dǎo)進入細胞內(nèi)。進入細胞后，在caspase-1作用下使IL-37脫離IgG并能將IL-37遞送至細胞核內(nèi)，發(fā)揮轉(zhuǎn)錄因子功能。也就是說 CPP-IgG2Fc-IL-37蛋白既能遞送細胞表面信號又能遞送細胞內(nèi)及核因子信號。而no CPP-IgG2Fc-IL-37蛋白因為沒有細胞穿透肽，也沒有蛋白酶切割位點，因此 no CPP-IgG2Fc-IL-37蛋白僅與細胞表面 IL-37受體結(jié)合而活化該受體信號通路。IL-37蛋白

10、帶有CPP及Ig融合蛋白的原創(chuàng)性設(shè)計，其通過細胞表面膜受體或兼具核轉(zhuǎn)錄因子通路的作用機制能夠被充分研究。
　　為了進一步確認 IL-37是否能夠通過誘導(dǎo)巨噬細胞表型轉(zhuǎn)變從而改善宿主肝臟血吸蟲蟲卵肉芽腫和肝纖維化的作用及其機制，本研究分為3個部分：一、檢測血吸蟲急性感染病人和正常人血清中IL-37的表達情況，初步探討IL-37是否與血吸蟲感染具有相關(guān)性；二、利用 C57BL/6小鼠制備日本血吸蟲感染模型，在感染后24天始分別給予重組

11、 IL-37(Recombinant IL-37, rIL-37)蛋白、CPP-IgG2Fc-IL-37蛋白(以下簡寫為CPP-IL-37)和no CPP-IgG2Fc-IL-37(以下簡寫為no CPP-IL-37)直至第6周，研究IL-37是否通過調(diào)節(jié)巨噬細胞表型轉(zhuǎn)變抑制宿主血吸蟲蟲卵肉芽腫形成及肝纖維化發(fā)展；三、在此基礎(chǔ)上，進一步以正常小鼠腹腔巨噬細胞為研究對象，分別加入rIL-37蛋白、no CPP-IL-37蛋白、CPP-IL

12、-37蛋白及Smad3抑制劑SIS3等共培養(yǎng)，探討該IL-37蛋白對巨噬細胞向M1/M2極化的影響，并探討IL-37對巨噬細胞極化的機制。
　　一、檢測血吸蟲急性感染病人和正常人血清中IL-37的表達情況
　　IL-37在炎性疾病和自身免疫性疾病的致病中扮演重要角色，且IL-37的表達水平與疾病的嚴重程度密切相關(guān)。本實驗收集14份日本血吸蟲急性感染病人血清和14份非流行區(qū)健康人血清，雙抗夾心ELISA檢測各組血清中IL-37

13、的表達情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)健康對照組低表達IL-37，而急性日本血吸蟲感染患者血清中IL-37的表達量明顯升高（p<0.05）。該實驗結(jié)果提示 IL-37作為一種抗炎性細胞因子，可能通過某種負反饋調(diào)節(jié)機制抑制炎癥因子，與血吸蟲病的發(fā)病及病程進展存在一定關(guān)系，可能在血吸蟲蟲卵肉芽腫反應(yīng)中起到抑制過度炎癥反應(yīng)、保護宿主機體的作用。
　　二、觀察IL-37處理后對小鼠肝臟血吸蟲蟲卵肉芽腫和肝纖維化的影響
　　為了進一步明確 IL-37在

14、日本血吸蟲感染小鼠肝臟肉芽腫和肝纖維化病變中的作用，小鼠血吸蟲感染后第24d開始通過尾靜脈注射分別給予合適劑量的rIL-37、no CPP-IL-37或CPP-IL-37蛋白，每隔3d一次，于感染后42天剖殺小鼠，觀察血吸蟲感染小鼠經(jīng)IL-37治療后對處理肉芽腫炎癥反應(yīng)和肝纖維化的影響；并采用HE染色、Masson染色、qRT-PCR、FACS及免疫組化等技術(shù)從細胞、分子水平分析其機制。
　　結(jié)果顯示：不同劑型的IL-37蛋白處理

15、后對感染小鼠的蟲荷、卵荷、肝臟重量沒有明顯影響。但肉眼可見IL-37處理組小鼠肝臟大體外觀明顯改善，肝臟表面蟲卵結(jié)節(jié)減少；尤以CPP-IL-37蛋白治療組肝臟外觀改善最明顯。HE染色結(jié)果顯示不同劑型的IL-37蛋白處理組小鼠肝臟蟲卵肉芽腫中浸潤的炎性細胞明顯減少，肝細胞壞死明顯減輕，與感染對照組相比，發(fā)現(xiàn)IL-37處理組小鼠肝臟蟲卵肉芽腫面積明顯減小(p<0.05）；尤以CPP-IL-37蛋白處理組肉芽腫面積減小最為明顯，經(jīng)統(tǒng)計學(xué)分析后

16、三種不同的 IL-37處理組之間肝臟蟲卵肉芽腫面積差異沒有顯著性（p>0.05）。不同劑型的IL-37蛋白處理組小鼠血清中轉(zhuǎn)氨酶AST和ALT水平均明顯低于感染對照組(p<0.05)；其中CPP-IL-37蛋白和no CPP-IL-37蛋白處理組肝功能損害減輕最為明顯，rIL-37蛋白處理組肝功能損害恢復(fù)程度不如no CPP-IL-37蛋白和CPP-IL-37蛋白處理組(p<0.05）。同時發(fā)現(xiàn)不同劑型的IL-37蛋白處理組與感染對照組

17、相比，肝臟膠原纖維的間隔減少并變細（p<0.05）；其中CPP-IL-37蛋白處理組的纖維化面積減少最為明顯，IL-37蛋白處理組之間差別無統(tǒng)計學(xué)意義。接著我們通過免疫組化利用 anti-α-SMA多抗檢測各組小鼠肝臟α-SMA的表達情況，發(fā)現(xiàn)不同劑型的IL-37蛋白處理后α-SMA蛋白的表達量比感染對照組顯著減少(p<0.05）；其中CPP-IL-37蛋白處理組α-SMA的表達減少最為明顯，三種IL-37蛋白處理組之間差別無統(tǒng)計學(xué)意義

18、。而且不同劑型的IL-37蛋白處理組后與感染對照組相比小鼠肝臟組織中IL-17的 mRNA明顯下調(diào)，而TGF-β的 mRNA水平明顯上調(diào)(p<0.05）；更感興趣的是巨噬細胞M1細胞因子iNOS的mRNA水平也明顯下調(diào)，而巨噬細胞 M2細胞因子 Fizzl的 mRNA水平高于感染對照組(p<0.05）。FACS分析顯示不同劑型的IL-37蛋白處理后與感染對照組相比肝臟蟲卵肉芽腫細胞中 Treg細胞數(shù)和細胞比例明顯多于感染組（p<0.05

19、）；Th2細胞有所增多，而Th1細胞和Th17細胞有所減少，但感染鼠各組之間無統(tǒng)計學(xué)差異（p>0.05）；進一步分析發(fā)現(xiàn)，CPP-IL-37處理組 Treg細胞的比例顯著高于其他 IL-37治療組(p<0.05）。FACS分析同時還顯示不同劑型的IL-37蛋白處理后與感染對照組相比，M2型巨噬細胞數(shù)和細胞比例明顯增多（p<0.05），經(jīng) CPP-IL-37蛋白處理后 M2比例升高的最多(p<0.01)。
　　以上結(jié)果揭示 IL-3

20、7通過誘導(dǎo)巨噬細胞向 M2極化進而影響其下游效應(yīng)細胞（Th細胞）功能從而抑制血吸蟲蟲卵肉芽腫反應(yīng)和肝臟纖維化，保護宿主肝臟功能。
　　三、探討IL-37誘導(dǎo)巨噬細胞向M2極化的作用機制
　　為了探究IL-37誘導(dǎo)巨噬細胞表型向M2轉(zhuǎn)變的機制，在體外分離和培養(yǎng)正常小鼠腹腔巨噬細胞（M0），分別用100ng/ml的 rIL-37、20ng/ml的 no CPP-IL-37蛋白、10ng/ml的CPP-IL-37蛋白或10ng/m

21、l的 CPP-IL-37蛋白+2μΜ的 SIS3與M0共培養(yǎng)12h。因CPP-IL-37蛋白帶有CPP，有助于IL-37蛋白進入細胞及細胞核內(nèi)發(fā)揮作用，為了觀察CPP-IL-37蛋白作為核轉(zhuǎn)錄因子的作用，在該實驗中加入Smad3的特異性抑制劑SIS3。FACS結(jié)果顯示不同劑型的IL-37蛋白作用于M0后，M0極化為M2的細胞比例與PBS對照組相比均明顯增多（p<0.01）；其中CPP-IL-37蛋白處理組誘導(dǎo)為 M2型巨噬細胞的比例最大

22、，與其他三組相比差異具有顯著性（p<0.05）。該實驗結(jié)果說明 IL-37可通過細胞表面受體信號通路及核轉(zhuǎn)錄因子途徑誘導(dǎo)巨噬細胞向M2極化。但M0預(yù)先用不同濃度的Compound C（AMPK抑制劑）處理后，CPP-IL-37蛋白誘導(dǎo)M0為M2的比例隨著AMPK抑制劑濃度的增加逐步下降。免疫印跡結(jié)果顯示用rIL-37、no CPP-IL-37和CPP-IL-37蛋白誘導(dǎo)巨噬細胞12h后，pAMPK蛋白的表達均明顯提高（p<0.01），尤

23、其 CPP-IL-37蛋白處理組 pAMPK蛋白的表達量最高（p<0.01），經(jīng) SIS3抑制后 pAMPK的表達量與rIL-37和no CPP-IL-37蛋白處理組基本相似（p>0.05）。說明IL-37能夠促進巨噬細胞內(nèi)AMPK的活化，活化的AMPK能夠促進巨噬細胞向M2極化，從而調(diào)控機體過度的炎癥反應(yīng)。
　　總之，本研究首次描述了IL-37在急性血吸蟲感染患者的血清中含量明顯升高；C57BL/6小鼠感染日本血吸蟲后，經(jīng)IL-

24、37處理后小鼠的肝臟蟲卵肉芽腫和肝纖維化程度明顯減輕，小鼠肝臟和腹腔M2型巨噬細胞的比例明顯增多；體外實驗用IL-37誘導(dǎo)正常小鼠腹腔巨噬細胞向M2的極化的比例也明顯增多，同時IL-37處理后明顯促進巨噬細胞內(nèi)AMPK的活化，Smad3能增強IL-37的抑炎功能。本研究還首次證明我們制備的CPP-IL-37蛋白使用較低的工作濃度卻發(fā)揮了更好的作用效果。擁有自主知識產(chǎn)權(quán)的no CPP-IL-37和CPP-IL-37蛋白不僅便于本課題的實施