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文檔簡介
1、血吸蟲病的發(fā)病機制主要是蟲卵引發(fā)的宿主的肝臟和腸等臟器組織產(chǎn)生肉芽腫病變,并繼發(fā)纖維化。其實質(zhì)是由于CD4+T淋巴細胞持續(xù)對蟲卵抗原發(fā)生免疫應答。研究表明,Th1/Th2免疫偏移與血吸蟲病蟲卵肉芽腫的發(fā)生、發(fā)展及免疫調(diào)節(jié)網(wǎng)絡密切相關。Th17和Tfh是近年來備受關注的兩個新T細胞亞群。已有研究證實ICOSL/ICOS信號在血吸蟲導致的慢性炎癥及纖維化形成過程中有重要作用。最新研究表明,ICOS的表達與Th17的產(chǎn)生直接相關,亦與Tfh功
2、能密切相關。本課題應用ICOS轉(zhuǎn)基因及ICOSL敲基因小鼠作為血吸蟲病實驗動物模型,結(jié)合體內(nèi)外實驗共同闡明Th17細胞介導的血吸蟲卵肉芽腫以及肝纖維化形成的分子機制,并初步探討ICOSL/ICOS信號對Tfh極化的影響,探索以ICOSL/ICOS信號通路為靶點調(diào)節(jié)Th17及Tfh極化,下調(diào)或控制蟲卵肉芽腫反應,抑制或防止肝纖維化的發(fā)生與進展,尋找控制血吸蟲性肝纖維化的新途徑。本研究分為五個部分:
第一部分:ICOSL-KO/I
3、COS-Tg小鼠感染日本血吸蟲病程中Th17極化相關分子的動態(tài)變化。
目的:探討ICOSL-KO/ICOS-Tg小鼠感染日本血吸蟲后,ICOSL/ICOS信號的增強或減弱對與Th17極化相關的共刺激分子、轉(zhuǎn)錄因子及細胞因子表達水平的影響。
方法:在日本血吸蟲感染前(0周)和感染早期階段(4周)、急性病變期(7周)、慢性期(12周)、晚期(16周)應用流式細胞儀檢測ICOSL-KO/ICOS-Tg小鼠及其野生型對照小鼠
4、CD4+T淋巴細胞上ICOS、CD154、IL-17A、RORγt和CD19+B淋巴細胞上ICOSL、CD40、IL-17R的表達水平。應用免疫組織化學方法檢測同期ICOSL-KO/ICOS-Tg小鼠及其野生型對照小鼠肝組織IL-17A的表達水平。
結(jié)果:流式細胞儀檢測結(jié)果顯示:感染日本血吸蟲后野生型小鼠脾CD4+T淋巴細胞上ICOS、CD154以及脾CD19+B淋巴細胞上CD40的表達水平從感染4周后升高,感染12周后達到峰
5、值,隨后緩慢下降。ICOSL-KO小鼠脾CD4+T淋巴細胞上ICOS、CD154的表達與同期野生型小鼠相比顯著下調(diào),ICOS的表達在感染4周后各病期均顯著下調(diào)。CD154在感染12周后顯著下調(diào)。由于ICOSL敲除,在血吸蟲感染后各病期CD19+B淋巴細胞上ICOSL的表達都極低。同時,Th17特異性的轉(zhuǎn)錄因子RORγt以及其重要的作用因子IL-17A在ICOSL-KO小鼠的脾CD4+T淋巴細胞上的表達均顯著下調(diào);ICOS-Tg小鼠的檢測
6、結(jié)果則恰好相反。免疫組織化學法檢測IL-17A在肝組織的表達水平的結(jié)果與流式細胞術(shù)的結(jié)果一致。
結(jié)論:ICOSL/ICOS信號的缺失可導致Th17亞群數(shù)量及功能的抑制;而加強該信號則誘導免疫應答向Th17偏移。
第二部分:日本血吸蟲感染ICOSL-KO/ICOS-Tg小鼠致病過程中ICOSL/ICOS信號對Th17極化的影響
目的:探討ICOSL-KO/ICOS-Tg小鼠感染日本血吸蟲后, ICOSL/IC
7、OS信號缺失或增強對Th17極化的影響。
方法:收集感染前(0周)和感染后4周、7周、12周、16周、20周的小鼠脾淋巴細胞,與SEA共培養(yǎng),誘導72小時后收集培養(yǎng)上清,應用ELISA法檢測培養(yǎng)上清中Th17型細胞因子IL-17、IL-23、IL-6; Th2型細胞因子IL-4、IL-13、TGF-β1;Th1型細胞因子IL-2、IFN-γ、IL-12。
結(jié)果:Th1型細胞因子IL-2、IFN-γ在ICOSL-KO小
8、鼠脾淋巴細胞培養(yǎng)上清中的表達水平與其野生型對照相比呈顯著上調(diào);Th2型細胞因子IL-4、IL-13、TGF-β1與其野生型對照相比表達則呈顯著下調(diào);Th17型細胞因子IL-17、IL-6、IL-23與其野生型對照相比表達亦呈顯著下調(diào)。而ICOS-Tg小鼠與其野生型對照相比,其脾淋巴細胞培養(yǎng)上清中Th1細胞因子IFN-γ呈顯著下調(diào);Th2細胞因子IL-13、IL-4則呈顯著上調(diào);Th17細胞因子IL-17亦呈顯著上調(diào)。
結(jié)論:進
9、一步證實了感染日本血吸蟲后隨著病程由急性期轉(zhuǎn)為慢性期,宿主的免疫應答由Th1型逐漸向Th2型轉(zhuǎn)化;同時,也提示,伴隨著蟲卵肉芽腫形成,下調(diào)ICOSL/ICOS信號可導致Th2/Th17免疫應答的減弱,該信號在介導日本血吸蟲感染宿主引發(fā)的免疫應答中對Th2/Th17極化的免疫效應可能起到重要作用。
第三部分:ICOSL-KO/ICOS-Tg小鼠感染日本血吸蟲ICOSL/ICOS信號介導肝蟲卵肉芽腫免疫應答及肝纖維化形成中的作用。
10、
目的:探討日本血吸蟲感染ICOSL-KO/ICOS-Tg小鼠后,ICOSL/ICOS信號缺失或增強對小鼠肝蟲卵肉芽腫病變及繼發(fā)性纖維化發(fā)生、發(fā)展的影響。
方法:觀察ICOSL-KO/ICOS-Tg小鼠感染日本血吸蟲后肝脾病變及重量的改變;運用HE染色法觀察肝臟蟲卵肉芽腫病變在ICOSL-KO/ICOS-Tg小鼠中的動態(tài)變化;Kaplan-Meier生存分析觀察ICOSL-KO/ICOS-Tg小鼠感染日本血吸蟲后的生
11、存率。運用Masson染色法觀察肝臟纖維化程度在ICOSL-KO/ICOS-Tg小鼠中的變化;應用免疫組織化學法檢測ICOSL-KO/ICOS-Tg小鼠肝組織中IL-13、TGF-β1、MMP-9、TIMP-1的表達水平動態(tài)變化。
結(jié)果:免疫組化檢測顯示,ICOS-Tg小鼠肝組織內(nèi)均可見明顯TGF-β1、IL-13陽性反應,呈片狀分布于蟲卵肉芽腫內(nèi)及其周圍匯管區(qū)、肝血竇,與其野生型對照相比,ICOS-Tg小鼠肝組織TGF-β1
12、、IL-13表達水平顯著增強;ICOSL-KO小鼠肝組織內(nèi)TGF-β1、IL-13陽性反應較少,與其野生型對照相比,TGF-β1、IL-13表達水平顯著下降。ICOS-Tg小鼠肝組織內(nèi)MMP-9、TIMP-1陽性反應呈棕黃色,表達于竇周、匯管區(qū)、蟲卵肉芽腫纖維組織內(nèi),與其野生型對照相比,MMP-9、TIMP-1表達水平顯著增強;ICOSL-KO組MMP-9、TIMP-1陽性反應較少,與其野生型對照相比,MMP-9、TIMP1表達水平顯著
13、減弱。另外,ICOS-Tg小鼠肝脾腫大明顯,肉芽腫體積增大,纖維化程度更為嚴重,生存率顯著下降;而ICOSL-KO小鼠則均與ICOS-Tg的表現(xiàn)相反。
結(jié)論:ICOSL/ICOS信號參與了日本血吸蟲感染宿主慢性致病過程的病理反應;ICOSL/ICOS信號的減弱或缺失可使血吸蟲性肝纖維化進程得到一定程度的抑制。該信號介導的Th2/Th17極化反應與肝蟲卵肉芽腫反應和繼發(fā)性纖維化的發(fā)生、發(fā)展密切相關。
第四部分:體外干預
14、ICOSL/ICOS信號通路對日本血吸蟲感染小鼠Th亞群極化的影響。
目的:探究日本血吸蟲感染ICOS-Tg小鼠后,ICOSL/ICOS信號通路對Th17極化的影響及體外干預ICOSL/ICOS信號通路對Th17極化的調(diào)節(jié)作用。
方法:收集感染前(0周)和感染后4周、7周、12周、16周、20周的小鼠脾淋巴細胞,與SEA共培養(yǎng),并運用ICOS單抗阻斷ICOSL/ICOS信號通路,收集培養(yǎng)上清,應用CBA技術(shù)(流式細胞
15、儀的液相蛋白定量技術(shù))檢測Th1、Th2、Th17型細胞因子。
結(jié)果:與野生型小鼠相比,ICOS-Tg小鼠產(chǎn)生較高水平的IL-17、IL-4和較低水平的IFN-γ。運用阻斷性單抗阻斷ICOSL后,ICOS-Tg小鼠脾淋巴細胞培養(yǎng)上清中Th1型細胞因子IFN-γ呈顯著上調(diào);Th2型細胞因子IL-4、IL-10、IL-13均顯著下調(diào),Th17型細胞因子IL-17亦顯著下調(diào);阻斷ICOS,也發(fā)生上述現(xiàn)象。
結(jié)論:干預ICO
16、SL/ICOS信號能顯著降低Th2/Th17型細胞因子的表達,調(diào)控免疫偏移的方向。
第五部分:ICOS-Tg小鼠感染日本血吸蟲病程中ICOSL/ICOS信號對Tfh極化的影響。
目的:探究日本血吸蟲感染ICOS-Tg小鼠后,ICOSL/ICOS信號增強對與Tfh極化相關的共刺激分子、轉(zhuǎn)錄因子及細胞因子表達水平的影響。
方法:感染日本血吸蟲前(0周)和感染后的早期(4周)、急性病變期(7周)、慢性期(12周)
17、、晚期(16周)的ICOS-Tg小鼠及其野生型對照小鼠的CD4+T淋巴細胞經(jīng)流式細胞儀檢測其CXCR5、BCL-6的表達及CXCR5+IL-21+細胞群和CXCR5+CD4+細胞上ICOS、CD40L的表達水平。應用免疫組織化學方法檢測同期ICOS-Tg小鼠及其野生型對照小鼠肝組織CXCR5、BCL-6的表達水平。脾淋巴細胞用SEA進行誘導72小時后收集上清,運用阻斷性單抗阻斷ICOSL/ICOS信號后檢測IL-21的表達。
18、結(jié)果:流式細胞術(shù)檢測結(jié)果顯示日本血吸蟲感染后野生型小鼠脾CD4+T淋巴細胞CXCR5、BCL-6、CXCR5+IL-21+細胞群的表達水平以及CXCR5+CD4+T淋巴細胞群上ICOS、CD40L的表達水平從感染4周后升高,感染12周后出現(xiàn)表達水平的峰值,然后緩慢的下降。以上檢測指標在ICOS-Tg小鼠中的表達水平與其野生型對照小鼠相比均顯著上調(diào)。免疫組織化學法檢測CXCR5和BCL-6在肝蟲卵肉芽腫周圍的表達水平的結(jié)果與流式細胞術(shù)的結(jié)
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