宿主免疫應(yīng)答對(duì)日本血吸蟲生長(zhǎng)、發(fā)育、生殖及對(duì)蟲卵肉芽腫形成的影響.pdf

1、傳統(tǒng)觀點(diǎn)認(rèn)為寄生蟲與宿主間的相互關(guān)系表現(xiàn)為寄生蟲對(duì)宿主的損害和宿主對(duì)寄生蟲的抵抗，而宿主對(duì)寄生蟲的抵抗主要表現(xiàn)為宿主的免疫應(yīng)答可以殺滅宿主體內(nèi)的部分寄生蟲并限制寄生蟲的再感染，與此同時(shí)，寄生蟲則利用各種方式逃避宿主的免疫攻擊。
　　 然而，新近研究及流行病學(xué)資料顯示，在宿主免疫功能低下時(shí)，血吸蟲的發(fā)育或生殖力受限，提示宿主的免疫反應(yīng)對(duì)血吸蟲的影響可能不光局限于限制或殺滅，血吸蟲對(duì)宿主的免疫攻擊可能也不僅限于逃避，我們的假設(shè)是：在

2、寄生蟲與宿主長(zhǎng)期共進(jìn)化過(guò)程中，血吸蟲為了生存，不僅設(shè)法逃避宿主的免疫攻擊，而且還可能利用宿主免疫反應(yīng)提供的某些效應(yīng)分子（如細(xì)胞因子、抗體等），促進(jìn)自身的發(fā)育或生殖，即宿主的免疫應(yīng)答可能有助于血吸蟲的發(fā)育或生殖。但是，迄今為止，哪種類型的免疫應(yīng)答或免疫反應(yīng)中哪些因素及效應(yīng)分子有利于血吸蟲的生長(zhǎng)和繁殖，還遠(yuǎn)不清楚。
　　 研制有效的抗血吸蟲疫苗是防治血吸蟲病的根本途徑，疫苗的研究工作已超過(guò)半個(gè)世紀(jì)，然而，迄今為止，該研究仍無(wú)實(shí)質(zhì)性進(jìn)

3、展。由于目前對(duì)血吸蟲感染免疫的認(rèn)識(shí)是建立在傳統(tǒng)觀點(diǎn)之上的，而抗血吸蟲疫苗研究的理論基礎(chǔ)也是建立在免疫反應(yīng)能殺滅蟲體或限制其產(chǎn)卵能力之上的，完全沒有考慮誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答是否會(huì)對(duì)血吸蟲產(chǎn)生有利作用。因此，深入認(rèn)識(shí)血吸蟲感染的免疫對(duì)血吸蟲生長(zhǎng)、發(fā)育及生殖的影響對(duì)疫苗研究尤為重要，闡明影響血吸蟲發(fā)育和繁殖的免疫應(yīng)答類型或效應(yīng)分子，將為在血吸蟲疫苗研究中如何激活不利于血吸蟲發(fā)育的因素而避免激活有利于血吸蟲發(fā)育的因素提供理論基礎(chǔ)。
　　 本研

4、究通過(guò)觀察日本血吸蟲在不同免疫缺陷動(dòng)物體內(nèi)的發(fā)育、生殖及宿主肝臟蟲卵肉芽腫的病理特點(diǎn)，探討不同免疫因素對(duì)日本血吸蟲發(fā)育、生殖及宿主蟲卵肉芽腫形成的影響。
　　 本論文包括如下三部分：
　　 第一部分 T細(xì)胞對(duì)日本血吸蟲生長(zhǎng)、發(fā)育、生殖及對(duì)蟲卵肉芽腫形成的影響
　　 第二部分信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄活化因子Stat4和Stat6對(duì)血吸蟲生長(zhǎng)、發(fā)育、生殖及對(duì)蟲卵肉芽腫形成的影響
　　 第三部分宿主細(xì)胞因子IL-12、I

5、L-4對(duì)血吸蟲生長(zhǎng)、發(fā)育、生殖及對(duì)蟲卵肉芽腫形成的影響
　　 第一部分:裸鼠是由于染色體內(nèi)裸體位點(diǎn)的等位基因（Nu基因）發(fā)生純合而形成的突變小鼠。該小鼠由于先天性胸腺缺陷，導(dǎo)致其體內(nèi)不能產(chǎn)生胸腺依賴淋巴細(xì)胞（T細(xì)胞）及其誘導(dǎo)的各類免疫反應(yīng)。我們利用裸鼠此特性，研究宿主T細(xì)胞缺陷對(duì)日本血吸蟲生長(zhǎng)、發(fā)育、生殖及對(duì)宿主肝臟蟲卵肉芽腫形成的影響。
　　 材料與方法:
　　 正常BALB/c小鼠及相同遺傳背景的裸鼠每只均感

6、染日本血吸蟲尾蚴25條。兩組小鼠各分3小組，分別于感染后第28天、35天及42天剖殺小鼠，經(jīng)門靜脈灌注法收集蟲體，計(jì)數(shù)總蟲荷，然后于解剖顯微鏡下分別計(jì)數(shù)雌、雄蟲荷，并觀察蟲體發(fā)育情況。所有蟲體經(jīng)10%福爾馬林固定后，鹽酸卡紅酒精染色，并置于載玻片上用中性樹膠封固。將封固蟲體的玻片置于光學(xué)顯微鏡下等倍數(shù)碼成像，并導(dǎo)入Image pro 5.0圖像分析程序，測(cè)量并計(jì)算蟲體的長(zhǎng)度。鏡下觀察蟲體，計(jì)數(shù)雌蟲子宮內(nèi)蟲卵數(shù)。
　　 門靜脈灌注

7、收集蟲體后摘取小鼠肝臟，從肝右葉切取部分新鮮肝組織，置于10%福爾馬林液中固定后，石蠟包埋、切片，HE染色，顯微鏡下組織病理學(xué)觀察。選擇切片中含單個(gè)蟲卵的肉芽腫，利用Image pro 5.0圖像分析系統(tǒng)，以蟲卵內(nèi)毛蚴為中心，測(cè)量肉芽腫直徑。剩余肝組織經(jīng)5%KOH溶液消化后，顯微鏡下計(jì)數(shù)蟲卵，并計(jì)算肝組織中每對(duì)蟲體平均產(chǎn)卵數(shù)。所有數(shù)據(jù)均以`c±s表示，用SPSS12.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，兩組間比較采用Student’s雙尾t檢驗(yàn)。

8、　　 結(jié)論:
　　 上述結(jié)果表明，宿主T細(xì)胞缺陷并不影響日本血吸蟲在宿主體內(nèi)的生存，且日本血吸蟲仍可在宿主體內(nèi)發(fā)育成熟并產(chǎn)卵。然而，T細(xì)胞缺陷時(shí)，蟲體發(fā)育及產(chǎn)卵明顯延遲，提示T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)及某些相關(guān)特異性免疫因子的產(chǎn)生可能有利于血吸蟲在宿主體內(nèi)的移行或發(fā)育，但通過(guò)動(dòng)態(tài)觀察，首次發(fā)現(xiàn)宿主T細(xì)胞缺陷對(duì)日本血吸蟲發(fā)育及產(chǎn)卵的影響是一過(guò)性的，主要作用于發(fā)育早期。
　　 第二部分:近年來(lái)，大量研究報(bào)道感染血吸蟲的宿主體內(nèi)輔

9、助性CD4+輔助性T細(xì)胞 (Th cell)的分化方向，即向Th1細(xì)胞或Th2細(xì)胞亞群的分化，對(duì)宿主的保護(hù)性免疫效應(yīng)及蟲卵肉芽腫的免疫病理反應(yīng)具有重要影響。
　　 Stat4和stat6分別為啟動(dòng)Th細(xì)胞向Th1細(xì)胞和Th2細(xì)胞亞群分化的重要信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子。當(dāng)Stat4缺乏時(shí)，刺激Th細(xì)胞向Th1細(xì)胞分化的信號(hào)途徑被阻斷，導(dǎo)致Th1型免疫反應(yīng)缺陷，而stat6缺乏則導(dǎo)致Th2型免疫反應(yīng)缺陷。
　　 本研究利用Stat4基因

10、敲除（Stat4-/-）小鼠和Stat6基因敲除（Stat6-/-）小鼠，分別觀察宿主Th1型免疫缺陷和Th2型免疫缺陷對(duì)日本血吸蟲發(fā)育生殖及宿主蟲卵肉芽腫形成的影響。
　　 材料與方法:
　　 正常BALB/c J小鼠及相同遺傳背景的Stat4-/-、Stat6-/-小鼠每只均感染日本血吸蟲尾蚴25條。三組小鼠各分3小組，分別于感染后第28天、35天及42天剖殺小鼠，經(jīng)門靜脈灌注法收集蟲體，計(jì)數(shù)總蟲荷及雌、雄蟲荷，并觀

11、察蟲體發(fā)育情況。所有蟲體卡紅染色后，測(cè)量蟲體的長(zhǎng)度，計(jì)數(shù)雌蟲子宮內(nèi)蟲卵數(shù)。門靜脈灌注收集蟲體后摘取小鼠肝臟，從肝右葉切取部分新鮮肝組織，置于10%福爾馬林液中固定后，石蠟包埋、切片，HE染色，顯微鏡下病理組織學(xué)觀察，測(cè)量切片中含單個(gè)蟲卵的肉芽腫直徑。剩余肝組織經(jīng)5%KOH溶液消化后，顯微鏡下計(jì)數(shù)蟲卵，并計(jì)算肝組織中每對(duì)蟲體平均產(chǎn)卵數(shù)（檢測(cè)方法同第一部分）。所有數(shù)據(jù)均以`c±s表示，用SPSS12.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，多組間比較采用單因素方

12、差分析(ANOVA)。型，纖維化不明顯。肉芽腫直徑在各組間無(wú)明顯差異（p>0.05）。
　　 結(jié)論:
　　 本研究發(fā)現(xiàn)Stat4-/-和Stat6-/-小鼠體內(nèi)蟲荷、蟲體長(zhǎng)度、肝組織中每對(duì)蟲體平均產(chǎn)卵數(shù)及雌蟲子宮內(nèi)蟲卵數(shù)與正常小鼠均無(wú)明顯差異，表明單純Th1型或Th2型免疫應(yīng)答對(duì)日本血吸蟲的生存、發(fā)育及生殖均無(wú)明顯影響。Stat4缺陷促進(jìn)蟲卵肉芽腫纖維化，提示Th1型免疫應(yīng)答對(duì)蟲卵肉芽腫的纖維化有抑制作用。Stat6缺陷

13、不利于蟲卵肉芽腫的形成及纖維化，提示Th2型免疫應(yīng)答對(duì)肉芽腫的形成及纖維化起關(guān)鍵作用。
　　 第三部分:研究報(bào)道，細(xì)胞因子的刺激對(duì)Th細(xì)胞的分化具有重要作用。初始CD4+Th細(xì)胞的分化受IL-12和IL-4的雙向調(diào)節(jié)。IL-12可促使初始Th細(xì)胞向Th1細(xì)胞分化，而IL-4可促使Th細(xì)胞向Th2細(xì)胞分化。血吸蟲感染中有關(guān)細(xì)胞因子的調(diào)控作用是目前的研究熱點(diǎn)。
　　 關(guān)于細(xì)胞因子功能的研究傳統(tǒng)方法是通過(guò)靜脈注射抗細(xì)胞因子單克

14、隆抗體來(lái)實(shí)現(xiàn)其中和作用。然而，觀察血吸蟲在終宿主體內(nèi)發(fā)育及蟲卵肉芽腫的形成需經(jīng)歷一個(gè)較長(zhǎng)的過(guò)程，而抗體在宿主體內(nèi)會(huì)逐步降解而不能持續(xù)發(fā)揮中和作用，將能分泌相應(yīng)單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞直接接種于實(shí)驗(yàn)動(dòng)物體內(nèi)，則可保證單克隆抗體的持續(xù)分泌并有效的分布于血液及組織中。
　　 本實(shí)驗(yàn)將抗IL-12和抗IL-4的雜交瘤細(xì)胞分別接種于小鼠背部皮下，通過(guò)雜交瘤細(xì)胞持續(xù)分泌的相應(yīng)單克隆抗體中和小鼠體內(nèi)的IL-12或IL-4，觀察這些細(xì)胞因子缺陷對(duì)

15、血吸蟲生長(zhǎng)、發(fā)育、生殖和對(duì)蟲卵肉芽腫形成的影響。
　　 材料與方法:
　　 將分泌抗小鼠IL-12的雜交瘤細(xì)胞(C 17.8)和分泌抗小鼠IL-4的雜交瘤細(xì)胞(11B11)經(jīng)PBS混懸后定量注射于BALB/c小鼠背部皮下，共接種兩次，兩次之間間隔三周。
　　 小鼠分為如下3組：
　　 1）抗IL-12組（小鼠接種抗IL-12雜交瘤細(xì)胞）
　　 2）抗IL-4組（小鼠接種抗IL-4雜交瘤細(xì)胞）<

16、br>　　 3）對(duì)照組（小鼠注射等體積PBS）
　　 每只小鼠于首次接種雜交瘤細(xì)胞后4～5天感染日本血吸蟲尾蚴25條。于感染后第0、28及42天用雙抗夾心ELISA法檢測(cè)各組小鼠血清中IL-12和IL-4水平。于感染后第28天和第42天，剖殺小鼠收集蟲體，計(jì)數(shù)總蟲荷及雌雄蟲配對(duì)數(shù)，對(duì)比各組小鼠體內(nèi)蟲體發(fā)育生殖狀況及肝臟蟲卵肉芽腫病理改變。所有蟲體經(jīng)鹽酸卡紅酒精染色，數(shù)碼成像，并導(dǎo)入Image pro 5.0圖像分析程序，測(cè)量

17、并計(jì)算蟲體的長(zhǎng)度，以了解蟲體發(fā)育情況；顯微鏡下計(jì)數(shù)雌蟲子宮內(nèi)蟲卵數(shù)；門靜脈灌注收集蟲體后摘取小鼠肝臟，經(jīng)消化后，計(jì)算肝組織中每對(duì)蟲體平均產(chǎn)卵數(shù)；感染后第42天，觀察小鼠肝組織病理學(xué)變化。
　　 所有數(shù)據(jù)均以`c±s表示，用SPSS12.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，多組間比較采用單因素方差分析(ANOVA)。
　　 結(jié)論:
　　 利用雜交瘤細(xì)胞皮下接種的方法能持續(xù)有效的中和小鼠血清中相應(yīng)細(xì)胞因子。IL-12或IL-4缺陷小鼠

18、體內(nèi)蟲荷與正常小鼠無(wú)顯著性差異，提示細(xì)胞因子IL-12或IL-4對(duì)宿主體內(nèi)血吸蟲的存活無(wú)明顯影響。然而，IL-12缺陷有利于血吸蟲發(fā)育，提示IL-12對(duì)血吸蟲發(fā)育可能有阻礙作用。IL-4對(duì)日本血吸蟲的發(fā)育無(wú)明顯作用?？笽L-12組產(chǎn)卵提前且感染早期產(chǎn)卵量較正常組高，然而隨著感染時(shí)間的延長(zhǎng)，其產(chǎn)卵量與正常小鼠無(wú)明顯差異，提示IL-12對(duì)雌蟲生殖的抑制作用可能是通過(guò)抑制其發(fā)育而實(shí)現(xiàn)的，此抑制作用是一過(guò)性的。抗IL-4處理可減弱蟲卵誘導(dǎo)的肝組