通過(guò)16SrRNA序列分析探討抑郁癥與腸道菌群之間的相互聯(lián)系.pdf

1、背景：抑郁癥是一種基因與環(huán)境相互作用的復(fù)雜精神疾病，嚴(yán)重危及人類健康；其患病率達(dá)15％，占全球疾病負(fù)擔(dān)的12.3%。WHO預(yù)測(cè)到2020年，抑郁癥將成為危害人類健康的第二大疾病。因此，加強(qiáng)抑郁癥預(yù)防、治療以及發(fā)病機(jī)制的研究迫在眉睫。抑郁癥發(fā)病機(jī)制學(xué)說(shuō)眾多，主要聚焦于腦內(nèi)分子異常學(xué)說(shuō)，包括神經(jīng)傳遞缺乏、神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)障礙、內(nèi)分泌免疫以及神經(jīng)解剖學(xué)等的異常。這些腦內(nèi)異常學(xué)說(shuō)為揭示抑郁癥的病因提供了一定的理論依據(jù)，但大都只能解釋某些方面的原因。例如

2、，臨床基于腦內(nèi)單胺類神經(jīng)遞質(zhì)失衡學(xué)說(shuō)而開(kāi)展的抗抑郁治療僅能使40%病人癥狀緩解。據(jù)此可見(jiàn)，抑郁癥發(fā)病機(jī)制中腦內(nèi)因素固然重要，但外環(huán)境因素及其作用機(jī)制更亟待闡明。人體內(nèi)腸道微生物細(xì)胞的數(shù)量是人體內(nèi)細(xì)胞數(shù)量的9倍,其基因總量約是人自身基因數(shù)目的150倍。因此，腸道微生物被認(rèn)為是人體最大、最直接的外環(huán)境，對(duì)維持人體健康發(fā)揮著重要作用。新近研究表明，腸道微生物能通過(guò)“微生物-腸-腦”軸來(lái)影響大腦神經(jīng)神經(jīng)生化和行為表型。課題組前期抑郁癥代謝組學(xué)研

3、究，發(fā)現(xiàn)抑郁癥患者伴有腸道微生物源的代謝物（例如馬尿酸鹽，二甲胺和二甲基甘氨酸）紊亂，提示腸道微生物紊亂可能是抑郁癥的一個(gè)重要特征，亟待闡明。
　　目的：采用16SrRNA基因測(cè)序方法，通過(guò)比較58例抑郁癥患者和63例健康對(duì)照組的糞便中腸道微生物的構(gòu)成，評(píng)估抑郁癥患者中腸道微生物是否發(fā)生了顯著性的改變，其紊亂的關(guān)鍵腸道微生物是什么，為深入研究腸道微生物與抑郁癥發(fā)病的關(guān)鍵奠定基礎(chǔ)。
　　方法：⑴采用DSM-IV--TR標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行

4、抑郁癥的診斷以及17項(xiàng)漢密爾頓抑郁評(píng)分量表(HDRS)來(lái)用于量化抑郁癥的嚴(yán)重性。共納入58名抑郁癥患者和63名匹配的健康正常對(duì)照。在納入的抑郁患者中，大多數(shù)（n=39）為未用藥抑郁患者，其余（n=19）正服用各種抗抑郁藥物。⑵從所招募的受試者中收集糞便標(biāo)本后，迅速將標(biāo)本冰凍并保存在-80℃冰箱內(nèi)，便于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。在液態(tài)氮中用研缽和杵將糞便樣品粉碎，用標(biāo)準(zhǔn)的DNA提取試劑盒獲得細(xì)菌基因組DNA。⑶羅氏454測(cè)序：將提取的16S rRNA基因

5、中的V3-V5區(qū)域片段利用通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。從454測(cè)序獲得的原始序列使用 Mothur版本1.31.2(http://www.mothur.org/)進(jìn)行質(zhì)量篩選獲得獨(dú)特的讀取片段。不到200bp序列和大于1000 bp序列以及含有引物錯(cuò)配，條形不匹配，模棱兩可的堿基序列，均聚物運(yùn)行超過(guò)6個(gè)基地的序列均被排除在外。剩余所有序列按照97%閾值以成對(duì)匹配的方式分配到操作分類單元（ OTUs）,使用 RDP參考數(shù)據(jù)庫(kù)(http://w

6、ww.mothur.org/wiki/RDP_reference_files)進(jìn)行分類。這些分類法通過(guò)總結(jié)各個(gè)操作分類單元（OTUs）的分布，可用于計(jì)算不同級(jí)別的菌群的相對(duì)豐度。菌群的α多樣性采用四種不同的參數(shù)進(jìn)行計(jì)算(i)觀察物種;(ii) Shannon多樣性指數(shù);(iii)系統(tǒng)發(fā)育多樣性；(iv) Simpson。β多樣性即樣本之間的距離多樣性，根據(jù)主坐標(biāo)分析(PCoA)基于加權(quán)和非加權(quán)(未加權(quán)的UniFrac)算法。執(zhí)行UniF

7、rac分析時(shí),使用PyNAST代表每個(gè)OTU序列是一致的，從這種一致的系統(tǒng)建成發(fā)育樹(shù)。隨機(jī)森林算法是通過(guò)評(píng)估每個(gè) OTU偏離預(yù)測(cè)值的誤差增長(zhǎng)程度來(lái)給每個(gè) OTU分配一個(gè)重要的分?jǐn)?shù)，我們采用這種算法來(lái)鑒定出關(guān)鍵性的OTU。
　　結(jié)果：①以16S核糖體RNA基因序列為基礎(chǔ)的測(cè)序方法，用來(lái)比較MDD患者和健康對(duì)照組的腸道微生物群落。從他們的糞便樣本中提取DNA，我們共獲得854639個(gè)高質(zhì)量的16S rRNA基因序列（7063±2352

8、讀取/糞便樣本），隨后在97%的相似性水平上被分為操作分類單元（OTUs）。這些OTUs多數(shù)屬于兩門菌種（厚壁菌門和擬桿菌門；83.1%±11.9%）。②菌群的α多樣性表明兩組之間無(wú)顯著性差異；而進(jìn)一步研究表明腸道菌群的β多樣性（加權(quán)UniFrac分析）即微生物系統(tǒng)發(fā)育的相似程度在MDD與健康人之間存在著不同。未加權(quán)的UniFrac分析三維圖顯示在MDD患者和健康對(duì)照組之間腸道微生物群落有明顯的差異。利用加權(quán) UniFrac分析也觀察到

9、抑郁癥患者和健康對(duì)照組之間的類似的區(qū)別?；祀s因素，包括分類變量（例如，性別、吸煙狀態(tài)和抗抑郁藥的使用）與連續(xù)變量（年齡、體重指數(shù)）未顯著影響腸道微生物的表型。③采用隨機(jī)森林，共鑒定出54個(gè)OTUs，其相對(duì)豐度能夠可靠的鑒別抑郁癥和健康對(duì)照的樣本。在這54個(gè) OTUs中，有29個(gè) OTUs的豐度在抑郁癥患者中高表達(dá)，主要?dú)w屬于：放線菌亞目，棒狀桿菌，乳酸桿菌，鏈球菌，梭菌XI(Parvimonas)，優(yōu)桿菌，毛螺旋菌（Anaerostip

10、es, Blautia, Dorea, Lachnospiracea incertae sedis），疣微菌科（梭菌屬 IV）， Erysipelotrichaceae incertae sedis；有25個(gè)OTUs的豐度在正常人中高表達(dá)，主要?dú)w屬于：擬桿菌，理炎菌（Alistipes），毛螺旋菌（Coprococcus, Clostridium XlVa, Lachnospiracea incertae sedis, Roseburi

11、a, and Faecalibacterium），氨基酸球菌（考拉桿菌），韋榮球菌（巨單胞菌）和Sutterellaceae。在門的水平,這些顯著差異的OTUs主要集中在厚壁菌(45/56,76.7%),放線菌(5/56,10.9%)和擬桿菌(3/56,5.3%)。與健康對(duì)照組相比,抑郁癥患者的放線菌的相對(duì)豐度增加,而擬桿菌的相對(duì)豐富減少。雖然厚壁菌在抑郁癥患者和健康對(duì)照組中總體相對(duì)豐度沒(méi)有明顯差異,但是仍是抑郁癥中標(biāo)志性改變的腸道微生

12、物。這是因?yàn)楹癖诰械囊恍㎡TUs的豐度(24/56)在抑郁患者中高表達(dá),而其他OTUs在抑郁患者中則表達(dá)降低。綜上，我們發(fā)現(xiàn)抑郁癥患者伴有顯著的腸道菌群的紊亂，而這些失調(diào)的微生物主要集中在厚壁菌,放線菌,擬桿菌這三種細(xì)菌。
　　結(jié)論：在抑郁癥患者與健康正常人中，腸道微生物群的構(gòu)成存在著顯著的改變和差異。與健康對(duì)照組相比，放線菌的相對(duì)豐度在抑郁癥患者中的表達(dá)增加，而擬桿菌的表達(dá)減少。此外,我們還發(fā)現(xiàn),厚壁菌也能鑒別抑郁癥患者和健康