PCR擴增16srRNA基因以快速診斷敗血癥及分型細菌.pdf

1、敗血癥是細菌進入血液引起的一種嚴重的全身感染性疾病,病情進展迅速,病死率高,早期診斷和有效的治療對病人預后至關(guān)重要。目前敗血癥的確診主要依靠血培養(yǎng)結(jié)果,但血培養(yǎng)方法陽性率低,耗時長,滯后于臨床的需求,導致臨床診斷困難。在治療方面,由于不能明確病原體,也只能先期應用大量廣譜抗生素治療,導致耐藥性致病菌的增加和病人負擔的加重,所以快速診斷敗血癥并對細菌初步分型是臨床亟待解決的難題。
　　 16SrRNA基因是細菌染色體上編碼rRNA

2、相對應的DNA序列,存在于所有細菌等原核生物中,但不存在于病毒、真菌等非原核生物中。16SrRNA基因高度保守,但這種保守是相對的,在其保守區(qū)之間存在9或10個變異區(qū),可變區(qū)和保守區(qū)交叉排列組成,保守區(qū)序列在所有細菌菌種中高度一致,而可變區(qū)序列則隨菌種的不同有較大的變化。本研究針對16SrRNA基因這一特點,在保守區(qū)設(shè)計通用引物,在可變區(qū)設(shè)計革蘭陽性與陰性特異引物,利用PCR技術(shù)快速診斷敗血癥并對致病菌初步分型,為臨床診治提供病原學依據(jù)

3、。
　　 1.敗血癥的快速診斷
　　 1.1在16SrRNA基因的保守區(qū)內(nèi)設(shè)計通用引物,對引起敗血癥的常見細菌(金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、大腸埃希菌、肺炎克雷伯菌、腸球菌、腐生葡萄球菌)及陰性對照菌(新型隱球菌、白色念珠菌)和乙肝病毒進行擴增。陽性菌株均得到特異陽性條帶,陰性質(zhì)控未出現(xiàn)陽性條帶。
　　 1.2優(yōu)化聚合酶鏈反應(PCR)方法并通過不同濃度細菌來檢測方法的靈敏度,PCR方法的最低檢測濃度可達到1.

4、5×103CFU/L,顯著高于血培養(yǎng)方法。
　　 1.3檢測60例敗血癥患者及20例正常人血液標本中的16SrRNA基因,與血培養(yǎng)結(jié)果進行比較,PCR方法陽性率86.6％,血培養(yǎng)陽性率38.3％,PCR方法的陽性率明顯高于血培養(yǎng),結(jié)果有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。
　　 1.4隨機選取10份血培養(yǎng)陰性而PCR陽性血液標本進行測序,其中8份標本通過序列比對,鑒定出了標本中的細菌種屬。
　　 2.細菌的初步分型

5、>　　 2.1在16SrRNA基因的可變區(qū)分別設(shè)計革蘭陽性菌和革蘭陰性菌特異性引物,分別對革蘭陽性菌株(金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、腐生葡萄球菌、肺炎鏈球菌、化膿性鏈球菌、腸球菌)和革蘭陰性菌(大腸埃希菌、肺炎克雷伯菌、陰溝腸桿菌、奇異變形桿菌、銅綠假單胞菌)進行巢式PCR得到特異性條帶。
　　 2.2對20例血培養(yǎng)陽性血液標本進行檢測,得到的結(jié)果與血培養(yǎng)鑒定結(jié)果一致。
　　 本研究結(jié)果表明,利用PCR擴增16SrR