異丙酚后處理對(duì)抗心肌缺血的促生存效應(yīng)機(jī)制研究.pdf

1、背景：
　　 實(shí)驗(yàn)證明缺血后處理(ischemic postconditioning，I-postC）可以明顯對(duì)抗心肌缺血再灌注（ischemia/reperfusion，I/R）損傷。藥物性后處理在缺血后處理（I-postC）的基礎(chǔ)上提出，既不損傷器官又能產(chǎn)生缺血后處理效應(yīng)，更具臨床應(yīng)用價(jià)值。
　　 已有實(shí)驗(yàn)證明揮發(fā)性麻醉藥如異氟醚、七氟醚后處理具有心肌保護(hù)作用，那么靜脈麻醉藥物異丙酚后處理是否具有心肌保護(hù)作用尚需研究

2、證明。實(shí)驗(yàn)證明，異丙酚可以通過減少中性粒細(xì)胞集聚、改善冠狀動(dòng)脈內(nèi)皮功能、減少活性氧的產(chǎn)生以及降低線粒體內(nèi)鈣濃度等途徑保護(hù)心肌。近期研究發(fā)現(xiàn)主動(dòng)效應(yīng)在心肌保護(hù)作用中占據(jù)著更為重要的位置，細(xì)胞在受損同時(shí)，能夠啟動(dòng)一系列主動(dòng)效應(yīng)，激發(fā)細(xì)胞本身的內(nèi)源性抗損傷能力，增強(qiáng)細(xì)胞自我保護(hù)能力，稱之為促生存效應(yīng)。那異丙酚后處理是否通過激活心肌細(xì)胞自我保護(hù)機(jī)制，從而發(fā)揮促生存效應(yīng)呢？本課題擬從細(xì)胞凋亡、細(xì)胞自噬以及促生存信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路等方面對(duì)異丙酚后處理的心

3、肌保護(hù)作用機(jī)制進(jìn)行研究。
　　 第一部分心肌細(xì)胞培養(yǎng)以及缺氧復(fù)氧模型的建立及評(píng)價(jià)
　　 目的：
　　 探討心肌細(xì)胞分離、純化和培養(yǎng)方法；建立培養(yǎng)心肌細(xì)胞缺氧復(fù)氧實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ筒?duì)其進(jìn)行評(píng)價(jià)。
　　 方法：
　　 通過用改良的新生小鼠心肌細(xì)胞培養(yǎng)方法，選取新生1天內(nèi)SD大鼠，采用胰蛋白酶和膠原酶共同消化的方法分離出心肌細(xì)胞，結(jié)合差速貼壁和化學(xué)試劑抑制法純化。原代培養(yǎng)心肌細(xì)胞培養(yǎng)4天后，更換用無血清低糖培養(yǎng)

4、基于常規(guī)培養(yǎng)箱中過夜同步化。造模前換用平衡過的無血清低糖的DMEM 培養(yǎng)基培養(yǎng)，并置于厭氧培養(yǎng)箱或缺氧小室中培養(yǎng)。缺氧后，將細(xì)胞從厭氧培養(yǎng)箱或缺氧小室中取出，更換用含有血清的高糖DMEM 培養(yǎng)基置于常規(guī)培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4小時(shí)復(fù)氧。
　　 結(jié)果：
　　 原代培養(yǎng)心肌細(xì)胞呈島嶼狀的自發(fā)性搏動(dòng)，頻率為90-150次/分。臺(tái)盼藍(lán)排斥實(shí)驗(yàn)證實(shí)心肌細(xì)胞成活率95.5％。心肌細(xì)胞內(nèi)特異性肌動(dòng)蛋白免疫細(xì)胞化學(xué)染色陽性表達(dá)率為95％。造模后心

5、肌細(xì)胞均出現(xiàn)皺縮，搏動(dòng)性降低等心肌細(xì)胞受損的特征性表現(xiàn)，隨著缺氧時(shí)間的延長(zhǎng)心肌細(xì)胞受損加重。3小時(shí)，6小時(shí)缺氧細(xì)胞受損不明顯，但缺氧時(shí)間超過12 h時(shí)，細(xì)胞漂浮于培養(yǎng)基中造成較大誤差，所以本實(shí)驗(yàn)的時(shí)間組別均設(shè)置12 h 缺氧4小時(shí)復(fù)氧。
　　 結(jié)論：
　　 原代培養(yǎng)心肌細(xì)胞存活率高，純度高符合實(shí)驗(yàn)要求。厭氧培養(yǎng)箱和缺氧小室均可模擬心肌細(xì)胞的缺氧環(huán)境，并且可以造成較為穩(wěn)定的損傷。
　　 第二部分異丙酚后處理對(duì)抗心肌

6、缺血再灌注損傷中ERK/NF-κB信號(hào)通路作用研究目的：
　　 應(yīng)用原代培養(yǎng)心肌細(xì)胞缺氧復(fù)氧損傷模型，在心肌細(xì)胞復(fù)氧同時(shí)給予濃度梯度的異丙酚進(jìn)行后處理，觀察心肌細(xì)胞形態(tài)變化、凋亡情況以及ERK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等方面研究異丙酚后處理對(duì)心肌缺血再灌注損傷的保護(hù)作用并探索其促生存信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制。
　　 方法：
　　 采用MTT 法檢測(cè)異丙酚后處理對(duì)缺血再灌注損傷心肌細(xì)胞活力的影響；采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)活性氧；采用流式細(xì)胞儀A

7、nnexin Ⅴ-FITC/PI 雙標(biāo)法檢測(cè)細(xì)胞凋亡率；Real-time PCR 檢測(cè)凋亡相關(guān)基因caspase-3 mRNA表達(dá)的變化；western blot檢測(cè)ERK蛋白磷酸化表達(dá)水平變化；免疫熒光染色檢測(cè)NF-κB 亞基p65的核移位。
　　 應(yīng)用ERK 特異性抑制劑U0126對(duì)ERK 磷酸化水平以及NF-κB 亞基p65的核移位的影響。
　　 結(jié)果：
　　 MTT 結(jié)果顯示異丙酚后處理能夠顯著提高缺氧

8、復(fù)氧心肌細(xì)胞活力且在50μM以下呈濃度依賴性，50μM 以上細(xì)胞活力進(jìn)入平臺(tái)期。與此同時(shí)異丙酚后處理可以降低心肌細(xì)胞內(nèi)的ROS水平。熒光顯微鏡下，正常培養(yǎng)心肌細(xì)胞無明顯凋亡細(xì)胞，而缺氧復(fù)氧處理組可見部分細(xì)胞胞體縮小，胞質(zhì)濃縮，可見典型的新月形的凋亡小體。
　　 相反在心肌細(xì)胞復(fù)氧同時(shí)給予異丙酚處理，可見鏡下凋亡小體明顯減少。流式細(xì)胞儀Annexin Ⅴ/PI 雙標(biāo)檢測(cè)凋亡率結(jié)果顯示異丙酚后處理能夠減少缺氧復(fù)氧所致的心肌細(xì)胞凋亡，

9、早期凋亡細(xì)胞（Annexin Ⅴ+/PI-）占總細(xì)胞數(shù)的比例減小，同時(shí)相應(yīng)可抑制凋亡基因caspase-3 mRNA表達(dá)。Western blotting的結(jié)果顯示缺氧復(fù)氧心肌細(xì)胞組的磷酸化的ERK1/2表達(dá)量較正常對(duì)照組有微量上調(diào)，然而異丙酚后處理可以大幅度激活ERK/MAPK 導(dǎo)致ERK的磷酸化蛋白表達(dá)增多，并且大部分依賴于異丙酚后處理的作用。ERK的特異性抑制劑U0126幾乎可以完全抑制ERK1/2的磷酸化表達(dá)。
　　 缺

10、氧復(fù)氧組中心肌細(xì)胞核中NF-κB p65蛋白表達(dá)量增多，異丙酚后處理組后，NF-κBp65蛋白發(fā)生核移位的細(xì)胞數(shù)減少比較明顯。ERK的特異性抑制劑U0126 可以消除異丙酚后處理對(duì)NF-κB p65 核位移的抑制作用。
　　 結(jié)論：
　　 異丙酚缺血后處理對(duì)缺氧復(fù)氧心肌細(xì)胞有保護(hù)作用，可提高受損心肌的活力并減少凋亡心肌細(xì)胞數(shù)量以及抑制凋亡基因caspase-3 mRNA表達(dá)，其保護(hù)機(jī)制可能包括減低細(xì)胞內(nèi)活性氧水平，抑制N

11、F-κB 亞基p65的核移位。同時(shí)，對(duì)于ERK/MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的研究表明異丙酚后處理的保護(hù)作用可能是通過激活ERK 以抑制NF-κB核位移從而調(diào)控下游一系列信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和基因表達(dá)調(diào)控而實(shí)現(xiàn)的。
　　 第三部分異丙酚后處理中細(xì)胞自噬的保護(hù)作用以及相關(guān)JNK/MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)研究
　　 目的：
　　 針對(duì)異丙酚后處理對(duì)抗心肌缺血再灌注損傷過程中細(xì)胞自噬機(jī)制及與細(xì)胞凋亡關(guān)系進(jìn)行系統(tǒng)性研究。在心肌細(xì)胞復(fù)氧同時(shí)給予濃度梯

12、度的異丙酚進(jìn)行后處理，觀察心肌細(xì)胞形態(tài)變化、細(xì)胞自噬與凋亡情況以及JNK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等方面研究異丙酚后處理對(duì)心肌缺血再灌注損傷的保護(hù)作用并探索其信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制。
　　 方法：
　　 采用MTT 法檢測(cè)異丙酚后處理對(duì)缺血再灌注損傷心肌細(xì)胞活力的影響；采用流式細(xì)胞儀Annexin Ⅴ-FITC/PI 雙標(biāo)法檢測(cè)細(xì)胞凋亡率；Monodansylcadaverine (MDC)染色以及吖啶橙(Acridine orange，AO)染色

13、檢測(cè)細(xì)胞酸性空泡積聚情況；western blot檢測(cè)異丙酚后處理對(duì)LC3I 型向Ⅱ型轉(zhuǎn)化的影響以及JNK蛋白磷酸化表達(dá)水平變化的影響；應(yīng)用自噬抑制劑3-MA 以及JNK 抑制劑SP60125 觀察對(duì)心肌細(xì)胞自噬觸發(fā)的影響。
　　 結(jié)果：
　　 應(yīng)用Western blot 檢測(cè)LC3 I 向II 型轉(zhuǎn)化的方法，目前也已基本成為檢測(cè)自噬發(fā)生的金標(biāo)準(zhǔn)。MDC 染色和AO 染色作為輔助手段可以檢測(cè)細(xì)胞中的嗜酸性小體，說明溶酶

14、體活性上升，間接提示自噬的發(fā)生。這幾個(gè)實(shí)驗(yàn)的陽性結(jié)果證明在缺氧復(fù)氧心肌細(xì)胞中，可以被異丙酚后處理誘導(dǎo)進(jìn)一步發(fā)生細(xì)胞自噬。并且，從LC3 I 向II 型轉(zhuǎn)化的趨勢(shì)判斷，自噬是隨著異丙酚后處理的濃度梯度增強(qiáng)的。我們使用3-MA 有效抑制心肌細(xì)胞發(fā)生自噬后，凋亡的的細(xì)胞由6.7％增加到15.6％。說明抑制自噬發(fā)生，可以對(duì)消除異丙酚后處理對(duì)心肌細(xì)胞的保護(hù)作用。異丙酚后處理在進(jìn)一步激活細(xì)胞自噬的同時(shí)，JNK的磷酸化水平也得以提高，從而調(diào)控細(xì)胞自噬

15、的發(fā)生與發(fā)展。磷酸化形式的JNK 經(jīng)異丙酚后處理之后，呈濃度梯度性增加，說明該通路被有效的激活。
　　 JNK 特異性抑制劑SP600125 處理后的心肌細(xì)胞，無論是Westem blot 檢測(cè)LC3 I 至II 型的轉(zhuǎn)化，還是熒光顯微鏡下觀察均說明了自噬被抑制。同時(shí)，在細(xì)胞自噬被抑制的同時(shí)，JNK 特異性抑制劑SP600125 也可以抵消異丙酚后處理對(duì)心肌細(xì)胞的保護(hù)作用，從而證明JNK信號(hào)通路介導(dǎo)了缺氧復(fù)氧心肌細(xì)胞內(nèi)的細(xì)胞自噬