西安地區(qū)腸道病毒71型的分離鑒定及單克隆抗體的制備.pdf

1、腸道病毒71型(Enterovirus71, EV71)屬于小RNA病毒科腸道病毒屬的成員,最初由Schmidt等從腦脊液中分離出來,世界上許多國家相繼報道了EV71病毒在不同地區(qū)流行情況,近來在我國也呈逐年上升趨勢,感染EV71后,除了可以引起手足口病、皰疹性咽峽炎以外,還可以導致無菌性腦膜炎、腦炎、脊髓灰質(zhì)炎樣麻痹、神經(jīng)性肺水腫、心肌炎等疾病,嚴重威脅著兒童的生命健康。EV71病毒由60個相同的亞單位構(gòu)成,每個亞單位均包含VP1~V

2、P4四種結(jié)構(gòu)蛋白,據(jù)病毒衣殼蛋白VP1序列(891bp)的變異情況,將其分為A、B和C三個基因型,近年的研究表明[1],基因型B和C又可進一步分為不同亞型(B1~B5和C1~C4)。目前對EV71的分子流行病學研究主要是VP1、VP4基因及5’-UTR區(qū)的變異,而VP1最具有研究價值,因為它直接決定病毒的抗原性,是病毒主要的中和決定因子,有遺傳變異多樣性的特點,5’-UTR結(jié)構(gòu)涉及病毒的宿主范圍和病毒的毒力等多個方面的功能。腸道病毒71

3、型遺傳學上具有多變性,同一地區(qū)不同時間流行的EV71易發(fā)生基因型轉(zhuǎn)換,導致臨床癥狀在不同地區(qū)和不同時間均有差異。大多在一周內(nèi)可恢復,但少數(shù)低齡患兒可能只表現(xiàn)出中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染癥狀,增加了早期診斷的難度,目前,對EV71致病的分子機制了解還很少,通過何種受體進入宿主細胞尚不明了,現(xiàn)在還沒有研制出安全有效的特效藥和疫苗,所以,對這種病原體及時快速的檢測對于手足口病的診治有著至關重要的作用。
　　目的:對西安地區(qū)腸道病毒71型流行株進行

4、分離鑒定,經(jīng)初步提純,建立一種新的快速EV71抗體ELISA檢測方法,以提純獲得的EV71病毒作為抗原免疫小鼠,制備腸道病毒71型西安株單克隆抗體,構(gòu)建出穩(wěn)定分泌表達的雜交瘤細胞株,測定腹水效價,為以后研究EV71病毒的生物學功能及其早期診治防治奠定基礎。
　　方法:1.采集手足口病患兒咽部分泌物標本進行病毒分離和RT-PCR檢測,利用免疫熒光技術進行鑒定,并將提取的病毒RNA進行核苷酸序列測定;2.用聚乙二醇(PEG)沉淀法將分

5、離的EV71病毒進行初步濃縮、提純,獲得大量高濃度的EV71抗原,然后直接應用抗原包被酶標板,用已知EV17抗體陽性血清鑒定所提純抗原的免疫活性;3.用濃縮提純的EV71病毒作為免疫原免疫Balb/c小鼠,末次加強免疫后3天取脾細胞與骨髓瘤SP2/0進行細胞融合,用HAT選擇培養(yǎng)基進行篩選,經(jīng)過3次有限稀釋克隆化,ELISA反復篩選,獲得穩(wěn)定分泌特異性抗體的雜交瘤細胞株,接種于小鼠體內(nèi)制備含有單克隆抗體的腹水,并檢測腹水效價。
　

6、　結(jié)果:1.原始標本直接用RT- PCR法擴增,陽性7份,陽性率31.8％(7/22);接種于RD細胞后成功分離10份陽性標本,陽性率為45.4％(10/22);然后運用RT-PCR(逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈式反應)從病毒培養(yǎng)上清中提取病毒RNA,發(fā)現(xiàn)病毒分離后再經(jīng)RT- PCR檢測的陽性率為68.1％,2.病毒分離后經(jīng)RT-PCR檢測陽性條帶切下測序,所得基因序列同GENEBAND報道的西安地區(qū)EV71流行株序列號(EU812461)完全一致,

7、免疫熒光鑒定結(jié)果陽性;3.分離提純的EV71病毒作為抗原直接包被酶標板,檢測經(jīng)臨床鑒定的EV71感染患兒陽性血清20份,陽性率85％,檢測柯薩奇病毒抗體陽性血清均為陰性;4.反復篩選獲得2株穩(wěn)定分泌抗EV71單克隆抗體的雜交瘤細胞株:EM1、EM2,經(jīng)過檢測腹水中抗體效價為10-4。
　　結(jié)論:1.EV71病毒在RD細胞中能很好的增殖,通過病毒培養(yǎng)能提高標本中EV71的核酸檢出率,標本在病毒分離前后的RT-PCR結(jié)果差異有統(tǒng)計學意