脂聯(lián)素對油酸誘導(dǎo)的脂肪變肝細(xì)胞p38MAPK和LPL表達(dá)的影響.pdf

1、背景與目的: 非酒精性脂肪性肝病(non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD)是一類肝組織學(xué)改變與酒精性脂肪肝病相似但無過量飲酒史的臨床病理綜合癥，一般認(rèn)為它是一種遺傳-環(huán)境-代謝應(yīng)激相關(guān)性疾病。在西方國家，NAFLD的人群患病率高達(dá)20％～40％，在我國近10年來增長迅速，已成為我國最常見的肝病之一。有關(guān)NAFLD的病因?qū)W、預(yù)防和治療已經(jīng)成為目前的研究熱點。NAFLD的發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明，

2、胰島素抵抗(IR)被公認(rèn)為是NAFLD發(fā)生的主要病理生理學(xué)機(jī)制之一，而脂聯(lián)素及其受體基因的多態(tài)性與IR、胰島素代謝的不同表現(xiàn)性密切相關(guān)，在體內(nèi)具有拮抗IR的作用，外源性給與脂聯(lián)素可改善糖耐量異常，防止高脂飲飼誘導(dǎo)IR。有研究表明激活p38MAPK信號通路介導(dǎo)了脂聯(lián)素引發(fā)的游離脂肪酸氧化和葡萄糖攝入過程。p38MAPK能活化過氧化物酶體增殖物激活受體α(PPARα)，而PPARα可直接促進(jìn)肝及巨噬細(xì)胞中脂蛋白脂酶(lipoprotein

3、lipase，LPL)基因的表達(dá)。從而提示脂聯(lián)素的異常在NAFLD的發(fā)病機(jī)制著重要的作用，而p38MAPK信號通路及LPL可能是脂聯(lián)素發(fā)揮作用的主要介導(dǎo)因子。但迄今為止，有關(guān)采用脂肪變肝細(xì)胞模型來探索脂聯(lián)素在NAFLD發(fā)生中的作用，及p38MAPK、LPL介導(dǎo)脂聯(lián)素信號機(jī)制的研究，國內(nèi)、外鮮見文獻(xiàn)報導(dǎo)。因此，本研究利用油酸誘導(dǎo)的脂肪變肝細(xì)胞模型，并采用RT-PCR、免疫印跡法等方法觀察了脂聯(lián)素對體外培養(yǎng)脂肪變肝細(xì)胞p38MAPK、LPL

4、表達(dá)及其生化指標(biāo)的影響，旨在初步闡明脂聯(lián)素在NAFLD的發(fā)病機(jī)制的作用及其信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制，進(jìn)而為NAFLD的臨床防治提供新思路。 方法： 采用正常成人L-02肝細(xì)胞株，隨機(jī)分為3組。①A組：正常對照組；②B組：油酸誘導(dǎo)組，正常培養(yǎng)基加油酸進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)；③C組：油酸聯(lián)合脂聯(lián)素組，正常培養(yǎng)基加油酸及脂聯(lián)素進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)。采用油酸誘導(dǎo)L-02肝細(xì)胞株建立肝細(xì)胞脂肪變性模型；采用油紅O染色觀察各組肝細(xì)胞脂滴變化的情況；采用RT-PC

5、R法檢測各組脂蛋白酯酶(LPL)mRNA的表達(dá)；采用Western印跡法檢測各組p38MAPK、磷酸化p38MAPK(p-p38MAPK)及LPL蛋白的表達(dá)；采用生化試劑盒檢測各組肝細(xì)胞內(nèi)甘油三酯(TG)的含量及培養(yǎng)液中ALT、AST水平。 結(jié)果： 1、油酸可誘導(dǎo)L-02肝細(xì)胞株脂肪變性，能成功建立肝細(xì)胞脂肪變細(xì)胞模型。在正常對照組，通過油紅O染色未觀察到橘色脂滴，細(xì)胞呈梭形，排列緊密，細(xì)胞核清晰可見；在油酸誘導(dǎo)組，隨培

6、養(yǎng)時間的增長，肝細(xì)胞脂肪變的程度呈加重的趨勢，培養(yǎng)24小時后可見肝細(xì)胞內(nèi)有少量橘色脂滴，脂變率(11.04±1.84)％；48小時有較多橘色脂滴，脂變率(34.96±6.98)％；72小時后則聚集了大量橘紅色脂滴，脂變率(74.83±12.41)％，且上述3個培養(yǎng)時相點脂變率的比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。在油酸聯(lián)合脂聯(lián)素組，與油酸誘導(dǎo)組對應(yīng)時相點比較，培養(yǎng)24小時后肝細(xì)胞脂變率無明顯差異(P>0.05)，但培養(yǎng)48小時、72

7、小時后其脂變率較油酸誘導(dǎo)組明顯降低(分別為(29.89±7.13)％、(38.47±6.94)％,P<0.05)。 2、各組肝細(xì)胞內(nèi)TG含量的比較 在油酸誘導(dǎo)組、油酸聯(lián)合脂聯(lián)素組，隨著培養(yǎng)時間延長，細(xì)胞內(nèi)TG含量均有增高的趨勢，油酸誘導(dǎo)組各時相點進(jìn)行組內(nèi)比較有顯著的統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.01)。與油酸誘導(dǎo)組對應(yīng)時相點比較，培養(yǎng)48小時，72小時后油酸聯(lián)合脂聯(lián)素組細(xì)胞內(nèi)TG含量明顯降低(P<0.05)。與正常對照組相對應(yīng)的各

8、時相點比較，油酸誘導(dǎo)組、油酸聯(lián)合脂聯(lián)素組TG含量均明顯增加(P<0.01)。 3、各組培養(yǎng)液中ALT、AST含量的比較 在油酸誘導(dǎo)組、油酸聯(lián)合脂聯(lián)素組，隨著培養(yǎng)時間延長，培養(yǎng)液中ALT、AST含量均有增高的趨勢，油酸誘導(dǎo)組各時相點進(jìn)行組內(nèi)比較有顯著的統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.01)。與油酸誘導(dǎo)組對應(yīng)時相點比較，培養(yǎng)48小時，72小時后油酸聯(lián)合脂聯(lián)素組細(xì)胞內(nèi)TG含量明顯降低(P<0.01)。與正常對照組相對應(yīng)的各時相點比較，油酸

9、誘導(dǎo)組、油酸聯(lián)合脂聯(lián)素組ALT、AST含量均明顯增加(P<0.01)。 4、各組肝細(xì)胞p38MAPK、p-p38MAPK蛋白表達(dá)的變化 在培養(yǎng)24小時、48小時、72小時后，正常對照組、油酸誘導(dǎo)組、油酸聯(lián)合脂聯(lián)素組p38MAPK蛋白均有明顯表達(dá)，但三組間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。在培養(yǎng)的各時相點，油酸誘導(dǎo)組、油酸聯(lián)合脂聯(lián)素組p-p38MAPK蛋白有一定程度的表達(dá)。而正常對照組無表達(dá)。油酸誘導(dǎo)組72小時與24、

10、48小時比較明顯增高(P<0.01)；油酸聯(lián)合脂聯(lián)素組各時相點進(jìn)行組內(nèi)比較無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)，但與油酸誘導(dǎo)組72小時比較，油酸聯(lián)合脂聯(lián)素組p-p38MAPK蛋白顯著降低(1.03±0.06 vs.2.87±0.16，P<0.01) 5、各組LPLmRNA表達(dá)的比較 在油酸誘導(dǎo)組，LPLmRNA在培養(yǎng)各時相點后有一定程度的表達(dá)，72小時與24、48小時比較有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。在油酸聯(lián)合脂聯(lián)素組，各時相點

11、LPLmRNA均有表達(dá)，隨著培養(yǎng)時間延長，其表達(dá)呈上升趨勢，各時相點間比較有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，且與油酸誘導(dǎo)組相對應(yīng)的各時相點比較，差異亦有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。 6、各組LPL蛋白表達(dá)的比較： 在油酸誘導(dǎo)組，LPL蛋白在培養(yǎng)后各時相點后有一定程度的表達(dá)，72小時與24、48小時比較有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。在油酸聯(lián)合脂聯(lián)素組，各時相點LPL蛋白均有表達(dá)，隨著培養(yǎng)時間延長，其表達(dá)呈上升趨勢，各時相點間比

12、較有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，且與油酸誘導(dǎo)組相對應(yīng)的各時相點比較，差異亦有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。 結(jié)論： 1、脂聯(lián)素可改善體外培養(yǎng)肝細(xì)胞脂肪變的程度。 2、脂聯(lián)素可明顯降低脂肪變肝細(xì)胞p-p38MAPK蛋白表達(dá)，促進(jìn)其LPL的表達(dá)，改善脂肪變肝細(xì)胞的生化指標(biāo)，提示脂聯(lián)素在非酒精性脂肪性肝病的發(fā)展過程中起著重要的作用。 3、p38MAPK信號通路及LPL可能是脂聯(lián)素發(fā)揮作用的重要因子，參與了肝細(xì)胞脂