p38MAPK在腦缺血耐受誘導過程中大鼠海馬中的表達.pdf

1、目的：MAPKs是一類高度保守的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，與細胞增殖、分化和凋亡密切相關的細胞內(nèi)信號轉導酶類，是細胞質(zhì)與細胞核聯(lián)系的關鍵途徑。研究發(fā)現(xiàn)，MAPKs信號轉導通路在腦缺血及腦缺血耐受誘導過程中可能發(fā)揮重要作用。p38 MAPK是1993年發(fā)現(xiàn)的MAPK家族的一種亞型，由360個氨基酸組成的38KDa的蛋白。研究發(fā)現(xiàn)亞致死量的腦缺血（2分鐘全腦缺血）通過激活p38 MAPK而提高蒙古沙鼠海馬錐體神經(jīng)元的缺血耐受性，使其能夠耐受其

2、通常情況下無法耐受的嚴重腦缺血（5分鐘的全腦缺血）；p38 MAPK的特異性抑制劑SB203580能夠劑量依賴性地阻斷2分鐘全腦缺血所誘導的腦缺血耐受。但是，p38 MAPK在腦缺血耐受誘導過程中的作用及機制還遠未闡明。因此，本次實驗旨在探討在體情況下，全腦缺血預處理中p38 MAPK在海馬中的表達，為臨床上腦血管疾病的防治研究提供新的線索和依據(jù)。
　　 方法：健康雄性Wistar大鼠160只，體重280-320g，隨即分為4組

3、。所有大鼠均首先永久凝閉椎動脈，恢復2天后，進行sham手術或腦缺血處理，具體分組如下：①sham組（n=40）：只暴露雙側頸總動脈，不阻斷血流；②腦缺血預處理（cerebral ischemic preconditioning，CIP）組（n=40）：夾閉雙側頸總動脈3 min后恢復再灌注；③損傷性缺血（ischemic insult，Ⅱ）組（n=40）：夾閉雙側頸總動脈8 min后恢復再灌注；④腦缺血預處理+損傷性缺血（CIP+Ⅱ）

4、組（n=40）：夾閉雙側頸總動脈3min作為腦缺血預處理，再灌2天后，再次夾閉雙側頸總動脈8min作為損傷性缺血，然后恢復再灌注。每個組又根據(jù)末次缺血或手術后動物存活時間的不同分為8個時間點：即刻（0分鐘）、15分鐘、30分鐘、3小時、1天、2天、4天、7天，每個時間點n=5。在規(guī)定的時間點，斷頭取海馬腦組織，硫堇染色進行神經(jīng)病理學評價；免疫組織化學染色法檢測p-p38 MAPK的表達。
　　 參照Kato分級方法，于光學顯微鏡

5、下對海馬CA1區(qū)組織學改變進行分級（Histological grade，HG），標準如下：0級，無神經(jīng)元死亡；1級，散在神經(jīng)元死亡；2級，成片神經(jīng)元死亡；3級，幾乎全部的神經(jīng)元死亡。取雙側平均等級作為統(tǒng)計值。高倍鏡下計數(shù)海馬CA1區(qū)每1 mm區(qū)段內(nèi)細胞膜完整、胞核飽滿、核仁清晰的錐體細胞數(shù)目，每張切片雙側海馬各計數(shù)3個區(qū)段，取平均數(shù)為神經(jīng)元密度（Neuronal density，ND）。
　　 結果：
　　 1神經(jīng)病理

6、學評價
　　 Sham組大鼠海馬CA1區(qū)，可見錐體神經(jīng)元排列整齊、致密、共2～3層，細胞形態(tài)完整，胞核飽滿，核仁清晰。HG為0～Ⅰ級。CIP組，各時間點錐體神經(jīng)元的形態(tài)、結構及數(shù)量沒有明顯區(qū)別，海馬CA1區(qū)無明顯的DND，HG為0～Ⅰ級，7d時ND分別為204±7.21和194.67±8.08。Ⅱ組8 min缺血打擊后，從4d開始海馬CA1區(qū)出現(xiàn)明顯的DND，7d時HG為Ⅱ～Ⅲ級、ND為17.33±11.37。與sham組相比，

7、HG明顯升高（P<0.01），ND顯著降低（P<0.01）。CIP+Ⅱ組各時間點海馬CA1區(qū)無明顯DND，7d時HG，為0～Ⅰ級，ND為190.67±4.16。與Ⅱ組相比，HG明顯降低（P<0.01），ND顯著升高（P<0.01）。表明CIP可以誘導海馬CA1區(qū)神經(jīng)元產(chǎn)生腦缺血耐受，使其能夠抵抗通常會引起明顯DND的嚴重腦缺血。CA3區(qū)的椎體神經(jīng)元，在各組的各個時間點均未見到明顯損傷。
　　 2磷酸化p38 MAPK在大鼠海馬C

8、A1區(qū)的表達
　　 2.1同組不同時間點的比較
　　 sham組海馬CA1區(qū)免疫陽性細胞形態(tài)完整，胞核胞漿界限不清，為淺棕黃色。各時間總面積和平均光密度均無顯著性差異。
　　 CIP組在15min時胞核著色開始變深，3h、1d時胞核明顯，呈深棕黃色，以3h最為明顯，此后神經(jīng)元胞核著色逐漸變淺，至7d時回落至即刻取材時間點水平。與即刻取材時間點相比，p-p38 MAPK陽性標記物的總面積在15min～4d均明顯增高

9、，但以1d最顯著，平均光密度在15min～1d時明顯升高，以3h最顯著（p<0.05）。
　　 Ⅱ組在即刻取材時間點免疫陽性物質(zhì)表達量少，15min開始逐漸增多，3h、1d達高峰，胞核呈均勻的深棕黃色。與即刻取材時間點相比，其陽性標記物的總面積和平均光密度在15min～2d均明顯升高（p<0.05），其中總面積以1d為最顯著，平均光密度以3h最顯著。4d和7d時表達量明顯降低，并有少量膠質(zhì)細胞著色，且著色程度明顯比神經(jīng)元深，與即

10、刻取材時間點相比，其染色總面積和平均光密度沒有明顯變化。
　　 CIP+Ⅱ組，即刻取材時間點可見免疫陽性物質(zhì)有一定量表達。15min時陽性標記物的表達明顯減少，細胞較稀疏，與即刻取材時間點相比陽性細胞的染色面積明顯減少（19<0.05），而平均光密度沒有明顯變化。30min時免疫陽性細胞表達開始增多基本和即刻取材時間點持平，胞核著色也開始加深至3h、1d、2d時神經(jīng)元著色明顯加深（p<0.05），以2d最為明，4d時神經(jīng)元著色明

11、顯變淺，基本恢復至對照組水平，并持續(xù)至7d。
　　 2.2同一時間點不同組之間比較
　　 即刻取材時間點，sham組、CIP組和Ⅱ組其免疫陽性標記物的總面積和平均光密度三組之間沒有明顯差異；CIP+Ⅱ其陽性標記物的總面積與Ⅱ組相比明顯升高，而平均光密度沒有明顯差異。
　　 在15min時， CIP組、Ⅱ組與sham組相比陽性標記物的總面積和平均光密度均明顯升高（p<0.05），Ⅱ組陽性標記物總面積升高更明顯。CI

12、P+Ⅱ組與Ⅱ組比較免疫陽性細胞表達減少，其染色總面積、平均光密度均明顯降低。
　　 30min時，CIP組、Ⅱ組與sham組相比其染色總面積、平均光密度均明顯增高（p<0.05）。Ⅱ組與CIP組相比，其免疫陽性標記物總面積、平均光密度均明顯升高。CIP+Ⅱ組與Ⅱ組比較陽性標記物的平均光密度明顯降低、但總面積沒有明顯變化。
　　 3h～2d時，CIP組、Ⅱ組與對應時間點的sham組相比，陽性標記物的總面積和平均光密度均明顯

13、升高，但Ⅱ組升高的更為顯著。CIP+Ⅱ與同時間點的Ⅱ組相比，其陽性標記物總面積在1d和2d時均明顯減少（p<0.05）。
　　 4d時，與sham組比較，CIP組的陽性標記物總面積、平均光密度均明顯增高（p<0.05）；Ⅱ組由于細胞發(fā)生遲發(fā)性神經(jīng)元死亡，其陽性標記物總面積較小，但平均光密度明顯增高（p<0.05）。CIP+Ⅱ組與Ⅱ組比較陽性染色總面積明顯升高。
　　 7d時，與sham組比較，CIP組的陽性標記物總面積明

14、顯增高（p<0.05）。Ⅱ組的總面積與sham組比較無明顯差異。CIP+Ⅱ組的陽性標記物總面積比Ⅱ組明顯增高（p<0.05）。
　　 3 p-p38 MAPK在海馬CA3區(qū)的表達
　　 sham組的各時間點之間相比，p-p38 MAPK陽性標記物總染色面積和平均光密度沒有顯著差異。
　　 CIP組，與即刻取材時間點相比，在1d時免疫陽性標記物總面積明顯增多（p<0.05），胞核深染，平均光密度也明顯升高（p<0.

15、05）。
　　 Ⅱ組，與即刻取材時間點比較，p-p38 MAPK陽性標記物的總面積在30min～2d時均明顯升高（p<0.05）以2d最為突出。
　　 CIP+Ⅱ組，在即刻取材時間點，胞核著色均勻一致，染色為淺棕黃色，15min時胞核染色明顯加深（p<0.05），但陽性標記物的總面積和即刻取材時間點比較明顯降低（p<0.05）。30min～1d免疫陽性細胞表達較15min時有所增多，但仍明顯低于即刻取材時間點水平。在2d

16、時，陽性標記物的總染色面積升高到即刻時間點水平，胞核深染，與即刻點比較p-p38 MAPK免疫陽性細胞的總染色面積沒有明顯變化，平均光密度顯著增高（p<0.05）。4d、7d時免疫陽性細胞表達明顯減少，細胞輪廓不清，胞核著色明顯變淺，與即刻取材時間點比較，免疫陽性細胞的總染色面積和平均光密度均明顯降低（p<0.05）。
　　 結論：
　　 1缺血打擊可以使海馬CA1區(qū)錐體神經(jīng)元發(fā)生遲發(fā)性死亡，提前2天的3min缺血預處理

17、可以防止這種死亡的發(fā)生，說明缺血預處理能夠誘導腦缺血耐受從而保護神經(jīng)元免受缺血打擊的影響。
　　 2缺血預處理可使大鼠海馬CA1區(qū)及CA3區(qū)錐體神經(jīng)元磷酸化的p38 MAPK表達適度增多，該變化可能保護海馬錐體神經(jīng)元使其能夠耐受之后的缺血打擊。
　　 3缺血打擊可使海馬CA1區(qū)p-p38 MAPK的表達大量增多，提示p-p38 MAPK的過度表達可能參與腦缺血損傷機制。
　　 4提前2d的3min缺血預處理可以防