腦缺血預(yù)處理通過p38MAPK介導(dǎo)GLT-1蛋白表達(dá)上調(diào)而誘導(dǎo)腦缺血耐受.pdf

1、目的:絲裂原活化蛋白激酶家族(Mitogen-activated protein kinase.MAPKs)是細(xì)胞內(nèi)廣泛存在的一類含絲氨酸/蘇氨酸殘基的蛋白激酶,介導(dǎo)細(xì)胞生長、發(fā)育、分裂、凋亡等多種生理過程。P38 MAPK是MAPKs家族的一個(gè)亞型,大量研究發(fā)現(xiàn),p38 MAPK信號傳導(dǎo)通路與腦缺血損傷及腦缺血耐受誘導(dǎo)有著密切聯(lián)系。我們既往的研究結(jié)果表明,在體腦缺血預(yù)處理通過引起星形膠質(zhì)細(xì)胞谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體-1(glial glutama

2、tetransporter-1,GLT-1)大量表達(dá)而誘導(dǎo)腦缺血耐受,但腦缺血預(yù)處理引起GLT-1大量表達(dá)的機(jī)制目前尚不清楚。腦缺血預(yù)處理是否通過p38 MAPK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路誘導(dǎo)GLT-1大量表達(dá)而發(fā)揮腦保護(hù)作用目前尚未見相關(guān)報(bào)道。因此,本實(shí)驗(yàn)旨在觀察腦缺血耐受誘導(dǎo)過程中,p38 MAPK激酶對大鼠海馬CA1區(qū)谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體GLT-1蛋白表達(dá)的影響,探討腦缺血預(yù)處理是否通過p38 MAPK通路誘導(dǎo)GLT-1蛋白大量表達(dá)而發(fā)揮保護(hù)作用,從而

3、為將來腦缺血性疾病的防治提供理論依據(jù)。
　　 方法:健康雄性Wistar大鼠(280～320g)300只,隨機(jī)分為以下三部分:
　　 1：腦缺血預(yù)處理對p-p38 MAPK蛋白及GLT-1蛋白表達(dá)的影響
　　 除control組之外,其余大鼠均首先永久凝閉椎動脈,恢復(fù)2天后,進(jìn)行假手術(shù)或腦缺血處理,具體分組如下:①control組(n=5);②sham組(n=45):只暴露雙側(cè)頸總動脈,不阻斷血流;③腦缺血預(yù)處理

4、(cerebralischemic preconditioning,CIP)組(n=45):夾閉雙側(cè)頸總動脈3 min,然后恢復(fù)血流再灌注;④損傷性缺血(ischemic insult,Ⅱ)組(n=45):夾閉雙側(cè)頸總動脈8 min,然后恢復(fù)血流再灌注;⑤CIP+Ⅱ組(n=45):夾閉雙側(cè)頸總動脈3 min作為腦缺血預(yù)處理,再灌2天后,再次夾閉雙側(cè)頸總動脈8min作為損傷性缺血,然后恢復(fù)再灌注。除control組之外的其余各組,又分為9

5、個(gè)時(shí)間點(diǎn),即假手術(shù)或末次缺血后0 min、15 min、30 min、3 h、6 h、1 d、2 d、4 d、7 d(每個(gè)時(shí)間點(diǎn)n=5)。
　　 在規(guī)定的時(shí)間點(diǎn),斷頭取海馬腦組織,硫堇染色進(jìn)行神經(jīng)病理學(xué)評價(jià);應(yīng)用Western blot法觀察p-p38 MAPK蛋白及GLT-1蛋白的表達(dá)。
　　 2：p38 MAPK的特異性抑制劑SB203580對腦缺血耐受誘導(dǎo)的影響
　　 具體分組如下:①sham組(n=5);

6、②CIP組(n=5);③Ⅱ組(n=5);④CIP+Ⅱ組(n=5);⑤SB203580+sham組(n=15):暴露頸動脈前30分鐘右側(cè)腦室注射p38 MAPK特異性抑制劑SB203580,其余步驟同sham組;⑥3％DMSO+CIP+Ⅱ組(n=5);暴露頸動脈前30分鐘右側(cè)腦室注射3％DMSO20μl,其余步驟同CIP+Ⅱ組;⑦SB203580+CIP+Ⅱ組(n=15):腦缺血預(yù)處理前30分鐘右側(cè)腦室注射SB203580,其余步驟同CI

7、P+Ⅱ組。其中,⑤、⑥、⑦組根據(jù)SB203580劑量不同,又分成1.25 nmol、2.5 nmol、5n mol3個(gè)亞組,每個(gè)亞組n=5。
　　 末次缺血或假手術(shù)后7天取材,應(yīng)用硫堇染色觀察海馬CA1區(qū)病理學(xué)分級和神經(jīng)元密度,探討p38 MAPK的特異性抑制劑SB203580對腦缺血耐受誘導(dǎo)的影響。
　　 3：p38 MAPK的特異性抑制劑SB203580對腦缺血耐受誘導(dǎo)過程中GLT-1蛋白表達(dá)的影響
　　 具

8、體分組如下:①3％DMSO+CIP+Ⅱ組(n=30);②SB203580+CIP+Ⅱ(n=60)。根據(jù)設(shè)計(jì),腦缺血預(yù)處理前30分鐘側(cè)腦室注射3％DMSO或SB203580,然后夾閉雙側(cè)頸總動脈3 min作為腦缺血預(yù)處理,再灌2天后,再次夾閉雙側(cè)頸總動脈8 min作為損傷性缺血,而后恢復(fù)再灌注。根據(jù)SB203580劑量不同,又分成2.5 nmol、5 nmol兩個(gè)亞組,每個(gè)亞組n=30。
　　 于末次缺血后即刻(0 min)、3

9、h、6 h、1 d、4 d、7 d時(shí)取海馬腦組織(每個(gè)時(shí)間點(diǎn)n=5),應(yīng)用western blot法觀察GLT-1蛋白的表達(dá),探討抑制p38 MAPK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路對GLT-1蛋白表達(dá)的影響。
　　 結(jié)果:
　　 1：在腦缺血耐受誘導(dǎo)過程中,大鼠海馬CA1區(qū)P-p38 MAPK蛋白和GLT-1蛋白的表達(dá)及其時(shí)間對比
　　 Western blot分析顯示,control組大鼠海馬CA1區(qū)有一定量的GLT-1蛋白的基

10、礎(chǔ)表達(dá)。但control組大鼠海馬CA1區(qū)p-p38MAPK蛋白的基礎(chǔ)表達(dá)極低。
　　 與control組相比,sham組GLT-1的表達(dá)在各時(shí)間點(diǎn)均有所上調(diào),IOD比值在各時(shí)間點(diǎn)均明顯升高(P＜0.01),以3 h最為顯著。與control組相比,sham組p-p38 MAPK的表達(dá)在各時(shí)間點(diǎn)均有所上調(diào),15 min時(shí)間點(diǎn)上調(diào)最明顯(P＜0.01)。
　　 CIP組各時(shí)間點(diǎn)GLT-1的表達(dá)較control組相比均上調(diào)(

11、P＜0.01);但與即刻取材時(shí)間點(diǎn)相比,GLT-1的表達(dá)從3 h時(shí)間點(diǎn)后開始明顯升高,以6 h、1 d時(shí)間點(diǎn)較明顯(P＜0.05)。CIP組各時(shí)間點(diǎn)p-p38 MAPK的表達(dá)較control組相比均上調(diào)(P＜0.01);但與即刻取材時(shí)間點(diǎn)相比,p-p38 MAPK的表達(dá)在15 min時(shí)間點(diǎn)就明顯上調(diào)(P＜0.05),但以3 h時(shí)間點(diǎn)達(dá)到高峰,并持續(xù)到1 d左右,2 d后p-p38 MAPK的表達(dá)有所降低(P＜0.05)。由此可見,CIP

12、引起了p-p38 MAPK的表達(dá)和GLT-1表達(dá)的不同步上調(diào),p-p38 MAPK的上調(diào)早于GLT-1表達(dá)的上調(diào)。
　　 Ⅱ組與即刻取材時(shí)間點(diǎn)相比,GLT-1蛋白的表達(dá)在15 min、30 min時(shí)間點(diǎn)無明顯變化(P＞0.05),從3 h時(shí)間點(diǎn)開始降低,隨著時(shí)間的推移逐漸降低,以4 d、7 d時(shí)間點(diǎn)最明顯(P＜0.01)。全腦缺血8 min后大鼠海馬CA1區(qū)p-p38 MAPK的表達(dá)明顯增高,其增高表現(xiàn)為雙峰狀,與即刻時(shí)間點(diǎn)相比

13、,第一次高峰發(fā)生于缺血后15 min,3 h時(shí)間點(diǎn)與即刻時(shí)間點(diǎn)相比無顯著差異(P＞0.05)。第二次高峰從缺血后6 h開始逐步升高,到4 d時(shí)達(dá)到其峰值,7 d時(shí)依然很高(P＜0.01)。上述結(jié)果表明,全腦缺血8 min后,p-p38MAPK的表達(dá)變化早于GLT-1蛋白的表達(dá);但p-p38 MAPK的表達(dá)明顯上調(diào),而GLT-1蛋白的表達(dá)明顯下調(diào)。
　　 CIP+Ⅱ組與control組相比,GLT-1的表達(dá)在即刻時(shí)間點(diǎn)明顯上調(diào)(P

14、＜0.01);與即刻取材時(shí)間點(diǎn)相比,在6 h時(shí)間點(diǎn)明顯升高(P＜0.01),其余時(shí)間點(diǎn)無明顯差異(P＞0.05)。P-p38MAPK的westcrn blot分析顯示,P-p38MAPK在早期即0 min、15 min、30 min、3 h時(shí)間點(diǎn)表達(dá)非常明顯(P＜0.01),6 h后表達(dá)明顯降低(P＜0.01)。上述結(jié)果表明,提前2天進(jìn)行的3min缺血預(yù)處理,阻斷了其后2 d進(jìn)行的8 min全腦缺血所引起的p-p38MAPK的過度表達(dá)上

15、調(diào)和GLT-1明顯下調(diào)。
　　 2：p38 MAPK的特異性抑制劑SB203580劑量依賴性地阻斷腦缺血預(yù)處理所誘導(dǎo)的腦缺血
　　 耐受硫堇染色顯示,sham組大鼠海馬CA1區(qū)錐體細(xì)胞排列整齊、致密,為2～3層,無細(xì)胞缺失,細(xì)胞形態(tài)完整,胞核飽滿,核仁深染、清晰。HG分級為0級,ND值為203±5.32(cells/mm,下同)。
　　 CIP組大鼠在各時(shí)間點(diǎn)海馬CA1區(qū)錐體神經(jīng)元均未見明顯損傷,與sham組相比

16、,HG、ND均無明顯差異(P＞0.05)。
　　 Ⅱ組大鼠在2天內(nèi)未見CA1區(qū)明顯的錐體神經(jīng)元損傷;7 d時(shí),細(xì)胞形態(tài)發(fā)生明顯改變,幾乎全部神經(jīng)元死亡或缺失,ND值為17±8.06,與sham組相比,HG明顯升高(P＜0.01),ND明顯降低(P＜0.01)。
　　 CIP+Ⅱ組大鼠在各時(shí)間點(diǎn)海馬CA1區(qū)錐體細(xì)胞排列整齊,胞核飽滿,核仁較清晰,僅個(gè)別錐體細(xì)胞胞核固縮,無明顯細(xì)胞缺失,7 d時(shí)與Ⅱ組的相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)相比,HG明

17、顯降低(P＜0.01),ND值為180±11.67、明顯升高(P＜0.01)。
　　 SB203580+sham組,無論是1.25 nmol、2.5 nmol還是5 nmol劑量組,其HG和ND與sham組相比均無明顯差異(P＞0.05)。
　　 3％DMSO+CIP+Ⅱ組的大鼠海馬CA1區(qū)錐體神經(jīng)元排列整齊,形態(tài)完整,未見損傷。與CIP+Ⅱ組相比,HG、ND(189±11.03)均無顯著差別(P＞0.05)。
　

18、　 SB203580+CIP+Ⅱ組中,隨著用藥劑量的加大可見海馬CA1區(qū)神經(jīng)元損傷加重:1.25 nmol組可見神經(jīng)元排列較稀疏,有少量錐體細(xì)胞出現(xiàn)形態(tài)不規(guī)則,核質(zhì)濃染現(xiàn)象,其HG與3％DMSo+CIP+Ⅱ組比較無明顯差異(P＞0.05),但ND略有下降(P＜0.05);2.5 nmol組可見CA1區(qū)的錐體神經(jīng)元發(fā)生明顯改變(P＜0.01),大量神經(jīng)元死亡或缺失,其HG與3％DMSO+CIP+Ⅱ組、及1.25nmol組相比較均明顯升高

19、(P＜0.01),ND均明顯下降(60±10.04);5 nmol組顯示海馬CA1區(qū)的神經(jīng)元幾乎全部死亡,其HG與3％DMSO+CIP+Ⅱ組比較明顯升高(P＜0.01),ND(15±7.23)明顯下降,與2.5 nmol組比較HG進(jìn)一步升高、ND進(jìn)一步降低(P＜0.05)。上述結(jié)果表明SB203580可以劑量依賴性地阻斷腦缺血預(yù)處理所誘導(dǎo)的腦缺血耐受。
　　 3：p38 MAPK的特異性抑制劑SB203580對腦缺血耐受誘導(dǎo)過程

20、中GLT-1蛋白表達(dá)的影響
　　 3％DMSO+CIP+Ⅱ組中在0 min、3 h、6 h、1 d、4 d、7 d共6個(gè)時(shí)間點(diǎn)GLT-1的表達(dá)均較高。與3％DMSO+CIP+Ⅱ組各個(gè)相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)相比,2.5 nmol SB203580+CIP+Ⅱ組、5 nmol SB203580+CIP+Ⅱ組兩個(gè)濃度分別作用下GLT-1蛋白的表達(dá)在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)均顯著降低(P＜0.01)。
　　 小結(jié):
　　 1：缺血預(yù)處理引起p-p

21、38 MAPK的表達(dá)和GLT-1表達(dá)的不同步上調(diào),且p-p38 MAPK的上調(diào)早于GLT-1表達(dá)的上調(diào)。
　　 2：缺血打擊后,p-p38 MAPK的表達(dá)變化早于GLT-1蛋白的表達(dá);但p-p38 MAPK的表達(dá)明顯上調(diào),而GLT-1蛋白的表達(dá)明顯下調(diào)。
　　 3：提前2天進(jìn)行的3 min缺血預(yù)處理,阻斷了其后2 d進(jìn)行的8 min全腦缺血所引起的p-p38 MAPK的過度表達(dá)上調(diào)和GLT-1明顯下調(diào)。
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