p38MAPK在槐耳誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡及自噬中的作用.pdf

1、本文從以下幾個(gè)部分進(jìn)行探討：
　　第一部分 槐耳抑制肝癌細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)其凋亡
　　目的:觀察槐耳對肝癌細(xì)胞增殖及凋亡的影響，并檢測相關(guān)標(biāo)志蛋白，明確槐耳誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡的具體途徑。
　　方法:MTT及單細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測槐耳對肝癌細(xì)胞增殖的影響，流式細(xì)胞術(shù)檢測肝癌細(xì)胞凋亡及周期分布，Hoechst33258染色觀測肝癌細(xì)胞凋亡小體，應(yīng)用全凋亡抑制劑Z-VAD-FMK觀察肝癌細(xì)胞凋亡變化，驗(yàn)證槐耳誘導(dǎo)凋亡。Wester

2、n blot檢測周期及凋亡相關(guān)蛋白Cyclin D1、Caspase3/8/9、PARP、Survivin、p53、Bcl-2家族蛋白，明確槐耳誘導(dǎo)凋亡的具體途徑。
　　結(jié)果:槐耳明顯抑制HepG2、Huh7增殖，并呈時(shí)間、濃度依賴性，藥物作用時(shí)間延長，濃度增加，細(xì)胞存活率隨之降低。流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果顯示隨著槐耳濃度的增加，細(xì)胞增殖周期阻滯效果越明顯，周期分布呈現(xiàn)濃度依賴性。周期相關(guān)蛋白Cyclin D1及CDK2在槐耳作用后表達(dá)

3、顯著下降。
　　在HepG2及Huh7細(xì)胞中，槐耳處理細(xì)胞后細(xì)胞凋亡率顯著上升，明顯高于對照組，相應(yīng)的PARP、Caspase3、8、9出現(xiàn)裂解，表達(dá)量顯著增加。Bcl-2家族蛋白中Bcl-2、Bcl-xL及Mcl-1表達(dá)均顯著降低，而Bim、Bax表達(dá)均顯著升高，同時(shí)抑癌蛋白P53表達(dá)顯著升高。Survivin在兩種細(xì)胞中表達(dá)均顯著下降。在應(yīng)用Z-VAD-FMK后，槐耳對肝癌細(xì)胞增殖的抑制顯著減弱，細(xì)胞增殖能力顯著回升，凋亡水平

4、顯著下降。而相應(yīng)的槐耳聯(lián)合Z-VAD-FMK作用后Caspase3及PARP蛋白表達(dá)量較槐耳組顯著下降。
　　結(jié)論:槐耳能夠阻滯肝癌細(xì)胞由G1期進(jìn)入S期，并抑制Cyclin D1的表達(dá)，與此同時(shí)還能夠誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞發(fā)生凋亡，并使Bcl-2家族抑凋亡蛋白表達(dá)降低，促凋亡蛋白表達(dá)升高?；倍€能使Survivin表達(dá)降低，并提高了p53的表達(dá)?；倍赡苁峭ㄟ^同時(shí)激活內(nèi)外源凋亡途徑來誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞發(fā)生凋亡。
　　第二部分 p38MAPK

5、信號(hào)通路調(diào)控槐耳誘導(dǎo)的肝癌細(xì)胞凋亡
　　目的:槐耳誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡的具體調(diào)控機(jī)制。
　　方法:Western blot檢測MAPK信號(hào)通路變化;應(yīng)用MAPK信號(hào)通路抑制劑后，通過MTT及流式細(xì)胞術(shù)觀察其對肝癌細(xì)胞增殖及凋亡的影響，Western blot檢測凋亡標(biāo)志性蛋白改變，明確主要調(diào)控通路;同時(shí)檢測Bcl-2家族蛋白、Survivin在MAPK抑制劑作用下表達(dá)的改變。
　　結(jié)果:槐耳作用于HepG2及Huh7細(xì)胞后

6、，MAPK三條主要途徑均活化。ERK及JNK在兩種細(xì)胞中4小時(shí)內(nèi)即顯著活化，但隨槐耳作用時(shí)間延長JNK及ERK表達(dá)逐漸下降;p38 MAPK在兩種細(xì)胞中活化最為顯著。
　　p38MAPK抑制劑顯著減弱槐耳對肝癌細(xì)胞的抑制作用。在HepG2及Huh7細(xì)胞中，p38MAPK抑制劑可以使肝癌細(xì)胞凋亡率顯著下降，JNK及ERK抑制劑則對肝癌細(xì)胞凋亡影響較小。MTT及克隆形成結(jié)果顯示p38MAPK抑制劑能夠顯著提高肝癌細(xì)胞的增殖能力，而ER

7、K及JNK抑制劑則未能產(chǎn)生顯著影響。相應(yīng)的p38 MAPK抑制劑作用后Cleaved Caspase3及PARP表達(dá)顯著下降，JNK抑制劑作用后蛋白表達(dá)無顯著變化，ERK抑制劑作用后Cleaved Caspase3及PARP表達(dá)均顯著上升。
　　p38MAPK抑制劑顯著影響B(tài)cl-2家族蛋白及Survivin表達(dá)。在HepG2及Huh7細(xì)胞中，加入p38MAPK抑制劑后，Bcl-2及Survivin表達(dá)顯著回升，而Bax則顯著下降

8、;JNK抑制劑作用后Bcl-2、Survivin表達(dá)均提高，但Bax表達(dá)變化不同;ERK抑制劑作用后Bax表達(dá)上升，而Bcl-2及Survivin表達(dá)則下降。
　　結(jié)論:MAPK三條途徑在槐耳作用后均活化，其中p38MAPK最為顯著。槐耳誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡可能是主要通過p38MAPK信號(hào)通路調(diào)節(jié)Survivin及Bcl-2家族蛋白來實(shí)現(xiàn)的。Survivin能夠減弱槐耳對肝癌細(xì)胞的抑制效果，聯(lián)合p38MAPK抑制劑后能夠進(jìn)一步減弱槐耳

9、的抗癌作用。Survivin可能是p38MAPK潛在的靶蛋白。
　　第三部分 p38MAPK信號(hào)通路參與調(diào)節(jié)槐耳誘導(dǎo)的肝癌細(xì)胞凋亡及自噬
　　目的:觀察槐耳能否誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞發(fā)生自噬，明確自噬對肝癌細(xì)胞凋亡的影響，研究MAPK信號(hào)通路對肝癌細(xì)胞自噬的影響及其調(diào)控機(jī)制。
　　方法: Western blot檢測自噬標(biāo)志性蛋白及AKT/mTOR信號(hào)通路蛋白，電鏡觀察自噬體形成;應(yīng)用自噬抑制劑及誘導(dǎo)劑后MTT及流式細(xì)胞術(shù)觀察自

10、噬對肝癌細(xì)胞增殖及凋亡的影響;MAPK抑制劑作用后觀察肝癌細(xì)胞自噬變化，明確調(diào)控機(jī)制。
　　結(jié)果:槐耳能夠誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞發(fā)生自噬，并抑制AKT/mTOR信號(hào)通路。p62表達(dá)量隨著槐耳作用時(shí)間的延長顯著下降，Beclin1表達(dá)量和LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值則顯著提高。而自噬上游相關(guān)蛋白AKT、mTOR及p70S6K在HepG2及Huh7中表達(dá)均顯著下降。
　　自噬顯著影響肝癌細(xì)胞的凋亡。在HepG2及Huh7細(xì)胞中，Rapamyci

11、n可以顯著降低槐耳誘導(dǎo)的肝癌細(xì)胞凋亡率;而應(yīng)用CQ則使細(xì)胞凋亡略升高，但與槐耳組相比凋亡率變化無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。MTT檢測顯示Rapamycin處理肝癌細(xì)胞后，細(xì)胞增殖能力較槐耳組顯著提高，而CQ作用后，細(xì)胞增殖率顯著下降。HepG2及Huh7細(xì)胞在Rapamycin處理后，Cleaved Caspase3表達(dá)較槐耳組明顯減少，而PARP在Rapamycin作用下有所減少;CQ作用后，Cleaved Caspase3表達(dá)水平顯著提高，而PA

12、RP表達(dá)量較槐耳組無顯著差異。
　　p38 MAPK及JNK參與調(diào)節(jié)槐耳誘導(dǎo)的肝癌細(xì)胞自噬。在HepG2及Huh7細(xì)胞中，與對照組相比，p38MAPK抑制劑作用后，細(xì)胞自噬顯著增強(qiáng)，Beclin1表達(dá)及LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值顯著提高，而p62表達(dá)顯著下降;JNK抑制劑則使Beclin1表達(dá)及LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值下降，p62表達(dá)升高;ERK抑制劑則對肝癌細(xì)胞自噬水平無顯著影響，Beclin1、p62及LC3表達(dá)均未發(fā)生顯著改變。免