肝X受體抑制對(duì)脂肪棕色化和代謝的影響及其分子機(jī)制研究.pdf

1、肥胖日益成為威脅人類健康的公共衛(wèi)生問題，暫無理想的解決方案。棕色脂肪可以增加能量消耗、改善胰島素抵抗，且近年來發(fā)現(xiàn)成人體內(nèi)存在棕色脂肪，因此成為治療肥胖及其相關(guān)代謝疾病的研究熱點(diǎn)。這些年來人們對(duì)于棕色脂肪的定義、生理特點(diǎn)、組胚來源、激活及誘導(dǎo)分化的方式、對(duì)于能量和糖脂代謝的影響，及與其相關(guān)的分子機(jī)制、信號(hào)通路都有了越來越深入的研究，亦不斷有新的認(rèn)識(shí)取代過去的誤解，然而尚未找到理想的藥物可以在人體中促進(jìn)脂肪棕色化。
　　肝X受體(L

2、XRs)與膽固醇、糖脂代謝關(guān)系密切，且有多個(gè)研究發(fā)現(xiàn)LXRs敲除與棕色脂肪的激活有關(guān)，但結(jié)論尚有爭(zhēng)議，具體機(jī)制也尚待進(jìn)一步研究。22-S-羥基膽固醇(22-S-hydroxycholesterol，22-S-HC)，作為L(zhǎng)XRs的抑制劑，目前發(fā)現(xiàn)它可以抑制脂肪合成、增加葡萄糖攝取，但它與脂肪棕色化之間的關(guān)系目前尚無研究。對(duì)于LXRs抑制在脂肪棕色化的作用這方面進(jìn)行研究，有助于進(jìn)一步了解核受體LXRs及其抑制劑22-S-HC在糖脂代謝方面

3、的作用，及其作為肥胖、糖尿病防治的新靶點(diǎn)和新型藥物的前景。
　　本研究建立了MEF細(xì)胞的棕色脂肪誘導(dǎo)模型，在此基礎(chǔ)上，分析研究了LXRs抑制劑22-S-HC對(duì)于MEF細(xì)胞向棕色脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)分化的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)22-S-HC可以促進(jìn)MEF細(xì)胞表達(dá)棕色脂肪細(xì)胞的特征。進(jìn)一步使用22-S-HC進(jìn)行體內(nèi)研究，同樣發(fā)現(xiàn)它能夠加強(qiáng)棕色脂肪功能并促使腹股溝白色脂肪棕色化，同時(shí)改善機(jī)體的糖脂代謝。對(duì)LXRs敲低的穩(wěn)篩MEF細(xì)胞進(jìn)行棕色化誘導(dǎo)，發(fā)現(xiàn)

4、LXRs敲低具有和22-S-HC相似的促進(jìn)棕色化的作用。在探索LXRs影響脂肪棕色化的分子機(jī)制的研究中，我們發(fā)現(xiàn)22-S-HC和LXRs敲低都可以激活UCP1、PPARγ、PGC1α的啟動(dòng)子活性。通過上述研究，我們揭示了22-S-HC對(duì)于肥胖、2型糖尿病的潛在治療價(jià)值以及部分分子機(jī)制。
　　本研究分為兩個(gè)部分:
　　第一部分:肝X受體抑制劑22-S-HC對(duì)于脂肪棕色化以及代謝的影響;
　　第二部分:肝X受體抑制對(duì)于脂肪

5、棕色化作用的分子機(jī)制研究。
　　第一部分肝X受體抑制劑22-S-HC對(duì)于脂肪棕色化以及代謝的影響
　　目的：
　　肝X受體是重要的代謝性核受體，近年來的研究發(fā)現(xiàn)肝X受體敲除可以促使脂肪棕色化，增加其特異性的功能蛋白-解偶聯(lián)蛋白1(uncoupling protein-1，UCP1)的表達(dá)。在這部分研究中，我們旨在體外和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)明確肝X受體抑制劑22-S-HC是否對(duì)于脂肪棕色化有促進(jìn)作用。
　　方法：
　　首

6、先，將MEF細(xì)胞經(jīng)棕色脂肪誘導(dǎo)方案誘導(dǎo)分化出棕色脂肪細(xì)胞的特征。建立了MEF細(xì)胞的棕色脂肪誘導(dǎo)模型后，將22-S-HC加入棕色誘導(dǎo)方案當(dāng)中，觀察22-S-HC是否對(duì)于脂肪棕色化有促進(jìn)作用。利用MTS明確22-S-HC對(duì)于MEF細(xì)胞的的安全濃度范圍，經(jīng)過油紅染色、線粒體-UCP1免疫熒光染色、Western blot和Real-time RT-PCR，對(duì)22-S-HC進(jìn)行濃度梯度和時(shí)間梯度的篩選，并觀察22-S-HC對(duì)于棕色化相關(guān)基因、糖

7、脂代謝相關(guān)基因表達(dá)的作用，以及對(duì)于糖脂代謝的影響。其次，建立飲食致肥胖小鼠模型，給予小鼠腹腔注射22-S-HC，觀察小鼠的體重變化;在22-S-HC干預(yù)前后進(jìn)行IPGTT和ITT，觀察糖代謝、胰島素抵抗是否改善;通過HE染色觀察脂肪組織的變化;通過Western blot和Real-time RT-PCR觀察UCP1和糖脂代謝相關(guān)基因的變化。
　　結(jié)果：
　　1)確立了MEF細(xì)胞向棕色脂肪細(xì)胞分化的誘導(dǎo)方案，通過Wester

8、n blot和線粒體-UCP1的免疫熒光染色明確了棕色脂肪誘導(dǎo)方案下的UCP1表達(dá)更明顯。
　　2)明確了22-S-HC對(duì)于MEF細(xì)胞的安全濃度范圍在10μM以內(nèi)，22-S-HC濃度在0.5、1μM的條件下，促進(jìn)MEF細(xì)胞的棕色誘導(dǎo)分化效果較好，Western blot以及Real-time RT-PCR提示UCP1表達(dá)顯著增加(P＜0.05)，線粒體-UCP1的免疫熒光染色更明顯;在誘導(dǎo)分化過程中，UCP1等棕色脂肪相關(guān)基因的表

9、達(dá)自第4天開始逐漸升高，基本在第14天時(shí)達(dá)到高峰。
　　3)Western blot以及Real-time RT-PCR提示22-S-HC可以促使棕色化相關(guān)基因UCP1和PGC1α的表達(dá)水平升高(P＜0.05); Real-time RT-PCR測(cè)得與糖脂代謝相關(guān)基因AP2、PPARγ、Adiponectin表達(dá)均顯著增加，SREBP1c顯著減少，以上差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);2NBDG攝取實(shí)驗(yàn)提示22-S-HC可以提高

10、已向棕色脂肪分化的MEF細(xì)胞攝取葡萄糖的能力(P＜0.05)。
　　4)在高脂喂養(yǎng)致肥胖小鼠模型中，22-S-HC腹腔注射組小鼠相比對(duì)照組小鼠的體重?zé)o明顯改變; IPGTT及ITT曲線下面積顯著減小(P＜0.05);棕色脂肪組織的脂滴減少，腹股溝脂肪組織的脂滴變小;棕色脂肪組織與腹股溝脂肪組織UCP1表達(dá)顯著增加(P＜0.05);22-S-HC對(duì)于不同脂肪組織的AP2、PPARγ、SREBP1c和Adiponectin表達(dá)有不同的

11、影響。
　　結(jié)論：
　　MEF細(xì)胞在棕色脂肪誘導(dǎo)方案下可以分化出棕色脂肪細(xì)胞的特征;22-S-HC在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中都可以促使脂肪棕色化，加強(qiáng)UCP1的表達(dá);22-S-HC可以改善葡萄糖脂肪代謝;22-S-HC對(duì)于糖脂代謝中的一些重要基因亦有影響;22-S-HC的作用具有組織特異性。
　　第二部分 肝X受體抑制促進(jìn)脂肪棕色化的分子機(jī)制研究
　　目的：
　　檢測(cè)敲低LXRs對(duì)于脂肪棕色化的作用與第一部分L

12、XRs抑制劑22-S-HC的作用是否一致，明確22-S-HC與LXRs敲低對(duì)于UCP1、PPARγ、PGC1α、COX2的啟動(dòng)子活性是否有影響。
　　方法：
　　通過公司設(shè)計(jì)和合成LXRs shRNA序列，制備含有上述序列的逆轉(zhuǎn)錄病毒，應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄病毒感染MEF細(xì)胞，檢測(cè)感染的效果;通過抗生素篩選建立穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系;將LXRs敲低的MEF細(xì)胞進(jìn)行棕色化誘導(dǎo)，觀察敲低組與對(duì)照組棕色化細(xì)胞特征的區(qū)別;構(gòu)建UCP1、PPARγ、PGC1

13、α、COX2的啟動(dòng)子報(bào)告基因質(zhì)粒，利用雙熒光素酶報(bào)告檢測(cè)系統(tǒng)來檢測(cè)22-S-HC和LXRs敲低對(duì)于上述啟動(dòng)子的作用。
　　結(jié)果：
　　1)成功地構(gòu)建了含有LXRs-shRNA序列的逆轉(zhuǎn)錄病毒，并篩選出效果最好的LXRα-shRNA3;成功地建立了穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系。
　　2)將穩(wěn)定敲低LXRα的MEF細(xì)胞進(jìn)行棕色化誘導(dǎo)后，油紅染色發(fā)現(xiàn)脂滴無明顯變化，Western blot和Real-time RT-PCR結(jié)果均顯示UCP1、

14、PPARγ、PGC1α的表達(dá)水平升高(P＜0.05);穩(wěn)轉(zhuǎn)敲低細(xì)胞系的葡萄糖攝取能力較對(duì)照組增加(P＜0.05)。
　　3)成功地構(gòu)建了UCP1、PPARγ、PGC1α、COX2的啟動(dòng)子報(bào)告基因質(zhì)粒，利用雙熒光素酶報(bào)告檢測(cè)系統(tǒng)來檢測(cè)22-S-HC和LXRs敲低對(duì)于上述啟動(dòng)子的作用，發(fā)現(xiàn)22-S-HC和LXRs的敲低對(duì)于UCP1、PPARγ、PGC1α啟動(dòng)子幾乎都有較高的激活(P＜0.05)，提示LXRs抑制可以對(duì)上述啟動(dòng)子起增強(qiáng)作