乳腺癌中DNA甲基化對SP1調(diào)控FOXF2轉(zhuǎn)錄及其功能的影響.pdf

1、研究背景：
　　叉頭框轉(zhuǎn)錄因子F2（forkhead box F2，F(xiàn)OXF2）屬于間質(zhì)特異性轉(zhuǎn)錄因子，通過調(diào)節(jié)細胞極性維持組織穩(wěn)態(tài)，在胚胎發(fā)育和組織分化過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)OXF2在基底細胞樣乳腺癌（basal-like breast cancer，BLBC）中特異性表達；FOXF2低表達通過誘導上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）而促進BLBC轉(zhuǎn)移

2、，但卻抑制癌細胞增殖。多項研究證實FOXF2在其他腫瘤的發(fā)生和發(fā)展中也發(fā)揮著重要作用，但是調(diào)控腫瘤中FOXF2特異性表達的分子機制未見報道。我們通過生物信息學分析FOXF2近端啟動子的DNA序列，發(fā)現(xiàn)其啟動子上存在一個CpG島，且CpG島中存在多個轉(zhuǎn)錄因子SP1的潛在結(jié)合位點。因此，我們推測DNA甲基化和轉(zhuǎn)錄因子SP1協(xié)同調(diào)節(jié)FOXF2在不同乳腺癌細胞亞型中表達及其在乳腺癌增殖和轉(zhuǎn)移中的作用。
　　目的：
　　本研究旨在闡明

3、DNA甲基化通過抑制轉(zhuǎn)錄因子SP1與FOXF2啟動子的結(jié)合而調(diào)控 FOXF2在不同乳腺癌細胞亞型中表達的分子機制，以及其在 FOXF2介導的SP1調(diào)控乳腺癌細胞轉(zhuǎn)移和增殖中的作用。
　　研究方法：
　　1、采用亞硫酸氫鹽測序PCR（bisulfite sequencing PCR，BSP）方法檢測luminal亞型乳腺癌細胞系 MCF-7和MDA-MB-453、basal-like亞型乳腺癌細胞系MDA-MB-231和永生化

4、乳腺上皮細胞系 MCF-10A、以及20例乳腺原發(fā)癌組織中FOXF2啟動子區(qū)的甲基化程度。同時，采用RT-QPCR方法檢測乳腺癌細胞系和乳腺癌組織中FOXF2 mRNA的表達水平，Western blot方法檢測乳腺癌細胞中FOXF2蛋白的表達水平。分析FOXF2啟動子的甲基化程度與其表達水平的相關(guān)性。
　　2、為了研究DNA甲基化對FOXF2表達的影響，分別用濃度梯度為0、0.5、1、1.5、2和2.5μM的DNA甲基轉(zhuǎn)移酶抑制

5、劑5-氮雜-2'-脫氧胞苷（5-Aza-2'-deoxycytidine，5-aza-dC）作用于乳腺癌細胞，然后通過RT-QPCR和Western blot方法檢測FOXF2表達水平的改變。
　　3、為了研究細胞內(nèi)甲基轉(zhuǎn)移酶（DNA methyltransferases，DNMTs）對 FOXF2表達的調(diào)節(jié)作用，分別采用小干擾RNA（small interference RNA，siRNA）沉默F(xiàn)OXF2啟動子高甲基化的MCF-

6、7和MDA-MB-453細胞中DNMT1、DNMT3A和DNMT3B的表達，然后通過RT-QPCR和Western blot方法檢測FOXF2表達的變化。同時，通過染色質(zhì)免疫沉淀（chromatin immunoprecitation，ChIP）實驗驗證MCF-7和MDA-MB-453細胞中DNMT1、DNMT3A、DNMT3B與甲基化的FOXF2啟動子的結(jié)合。
　　4、為了研究DNA甲基化是否可以直接抑制FOXF2啟動子的活性，

7、分別用甲基轉(zhuǎn)移酶SssI，HhaI和HpaII體外催化FOXF2啟動子–655 bp至+128 bp的區(qū)域發(fā)生不同程度的甲基化修飾，然后克隆入 pGL3-basic載體，并轉(zhuǎn)染MDA-MB-231細胞，最后采用雙熒光素酶報告系統(tǒng)檢測不同甲基化程度的FOXF2啟動子的轉(zhuǎn)錄活性。
　　5、分別采用ChIP和雙熒光素酶報告系統(tǒng)實驗驗證SP1對FOXF2啟動子的結(jié)合和轉(zhuǎn)錄激活作用；為了分析 SP1對 FOXF2表達的調(diào)節(jié)作用，在MDA-M

8、B-231和MCF-10A細胞中分別轉(zhuǎn)染SP1真核表達載體（SP1）或SP1 siRNA（siSP1），以及采用SP1特異性抑制劑光輝霉素（Mithramycin，MTM）處理MDA-MB-231和MCF-10A細胞，然后通過RT-QPCR和Western blot方法檢測FOXF2表達的變化。
　　6、為了研究DNA甲基化對SP1轉(zhuǎn)錄激活FOXF2啟動子活性的影響，用2μM的5-aza-dC處理MCF-7細胞，然后通過ChIP實

9、驗檢測SP1與FOXF2啟動子的結(jié)合能力的變化；SP1與不同甲基化狀態(tài)的FOXF2啟動子熒光報告質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染MDA-MB-231后，采用雙熒光素酶報告系統(tǒng)檢測SP1對不同甲基化程度的FOXF2啟動子的轉(zhuǎn)錄激活作用。
　　7、為了研究FOXF2介導SP1對乳腺癌細胞生物學行為的調(diào)控作用，分別在過表達 SP1的MDA-MB-231細胞中降表達 FOXF2，或在降表達 SP1的MCF-10A細胞中過表達FOXF2，然后通過體外Transw

10、ell和MTT實驗評價乳腺癌細胞生物學行為的改變，并采用Western blot方法檢測乳腺癌細胞中SP1、FOXF2和FOXF2靶基因TWIST1的表達。
　　8、為了研究 SP1-FOXF2通路對不同亞型乳腺癌轉(zhuǎn)移的影響，我們基于 GEO（gene expression omnibus）基因表達數(shù)據(jù)庫中一組427例乳腺癌患者的數(shù)據(jù)資料（登記號GSE25066），分別統(tǒng)計分析luminal亞型和Basal-like亞型乳腺癌患者

11、中SP1（probe set No.214732_at）和FOXF2（probe set No.206377_at） mRNA的表達水平與無遠處轉(zhuǎn)移生存（distant metastasis free survival，DMFS）的關(guān)系。
　　結(jié)果：
　　1、Basal-like亞型的MDA-MB-231和MCF-10A細胞中，F(xiàn)OXF2啟動子的甲基化程度低于luminal亞型的MCF-7和MDA-MB-453細胞，而MDA

12、-MB-231和MCF-10A細胞中 FOXF2 mRNA和蛋白表達水平高于 MCF-7和MDA-MB-453細胞。基于FOXF2 mRNA水平將20例乳腺癌組織分為FOXF2高表達組（FOXF2high；n=10）和FOXF2低表達組（FOXF2low；n=10），F(xiàn)OXF2high組中 FOXF2啟動子的甲基化程度顯著低于 FOXF2low組（P=0.027）。證實乳腺癌中FOXF2啟動子的甲基化程度與其表達水平呈負相關(guān)。
　

13、　2、在5-aza-dC處理的MCF-7和MDA-MB-453細胞中，F(xiàn)OXF2啟動子的甲基化程度顯著降低，F(xiàn)OXF2的表達水平隨著5-aza-dC濃度的增加而升高；在5-aza-dC處理的MDA-MB-231和MCF-10A細胞中，F(xiàn)OXF2的表達水平無明顯變化。證實乳腺癌中FOXF2啟動子的甲基化是抑制其表達的重要因素。
　　3、在MCF-7細胞中降表達DNMT1或DNMT3A可以上調(diào)FOXF2表達水平，而降表達DNMT3B對

14、其表達水平?jīng)]有影響；在MDA-MB-453細胞中降表達DNMT1或DNMT3B可以上調(diào)FOXF2表達水平，而降表達DNMT3A對其表達水平?jīng)]有影響。ChIP實驗證明MCF-7細胞中DNMT1和DNMT3A與FOXF2啟動子的CpG島結(jié)合，而DNMT3B的結(jié)合十分微弱；MDA-MB-453細胞中DNMT1和DNMT3A與FOXF2啟動子的CpG島結(jié)合，而DNMT3B的結(jié)合十分微弱。證實不同的乳腺癌細胞系中 DNMTs對 FOXF2的表達抑

15、制作用不同。
　　4、雙熒光素酶報告系統(tǒng)結(jié)果顯示，沒有甲基化的FOXF2啟動子活性最高，甲基轉(zhuǎn)移酶HhaI和HpaII催化的部分甲基化的FOXF2啟動子活性次之，而甲基轉(zhuǎn)移酶 SssI催化的完全甲基化的FOXF2啟動子的活性最低。證實 DNA甲基化可以直接抑制FOXF2啟動子的轉(zhuǎn)錄活性。
　　5、ChIP實驗證明SP1可以與FOXF2啟動子區(qū)結(jié)合；雙熒光素酶報告系統(tǒng)證實SP1可以增強 FOXF2啟動子的轉(zhuǎn)錄活性；在 FOXF

16、2啟動子低甲基化的MDA-MB-231和MCF-10A細胞中分別降表達或過表達SP1，F(xiàn)OXF2的表達也隨之降低或升高；MTM處理MDA-MB-231和MCF-10A細胞后，F(xiàn)OXF2的表達水平隨著MTM濃度的升高而降低。證實SP1轉(zhuǎn)錄促進FOXF2啟動子低甲基化的乳腺癌細胞中FOXF2的表達。
　　6、5-aza-dC處理MCF-7細胞后，ChIP實驗證明SP1與FOXF2啟動子區(qū)的結(jié)合能力增強。雙熒光素酶報告系統(tǒng)結(jié)果顯示過表達

17、 SP1對完全甲基化的FOXF2啟動子的轉(zhuǎn)錄活性沒有影響，但可以增強無甲基化和部分甲基化的FOXF2啟動子的轉(zhuǎn)錄活性。證實DNA甲基化抑制SP1對 FOXF2啟動子的轉(zhuǎn)錄激活。
　　7、過表達 SP1可以降低 MDA-MB-231細胞的遷移和侵襲能力，下調(diào) FOXF2的靶基因TWIST1的表達水平，但增強細胞增殖能力，而降表達FOXF2可以逆轉(zhuǎn)過表達 SP1所導致的細胞生物學行為的改變；降表達 SP1可以增強MCF-10A細胞的遷

18、移和侵襲能力，上調(diào)TWIST1的表達水平，但降低細胞增殖能力，而過表達FOXF2可以逆轉(zhuǎn)降表達SP1所導致的細胞生物學行為的改變。證實FOXF2介導SP1對乳腺癌細胞生物學行為的調(diào)控作用。
　　8、根據(jù)FOXF2和SP1 mRNA的表達水平將427例病人分為SP1high/FOXF2high組(n=111)，SP1low/FOXF2high組(n=65)，SP1high/FOXF2low組(n=154)和SP1low/FOXF2l

19、ow組(n=97)。Kaplan-Meier生存分析結(jié)果顯示，在basal-like亞型的乳腺癌患者中 SP1low/FOXF2low組患者的無遠處轉(zhuǎn)移生存率比其他三組患者低（P=0.0018），在luminal亞型的乳腺癌患者中四組患者的無遠處轉(zhuǎn)移生存率沒有統(tǒng)計學差異。證實SP1-FOXF2通路參與basal-like亞型乳腺癌的轉(zhuǎn)移，而與luminal亞型乳腺癌的轉(zhuǎn)移無關(guān)。
　　結(jié)論：
　　1、在乳腺癌中，DNA甲基化調(diào)