乳腺癌WWOX基因CpG島甲基化和肼苯噠嗪去甲基化的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、乳腺癌是一種常見(jiàn)的惡性腫瘤，抑癌基因和癌基因的異常表達(dá)是乳腺癌發(fā)生的重要機(jī)制。WWOX(WW domain containing oxidoreductase)基因是跨越了整個(gè)常見(jiàn)染色體脆性位點(diǎn)FRAl6D的一個(gè)新的抑癌基因，2000年由Bednarek等應(yīng)用鳥(niǎo)槍基因測(cè)序技術(shù)結(jié)合對(duì)感興趣對(duì)應(yīng)的轉(zhuǎn)錄子進(jìn)行分離并分析的方法鑒定出的一個(gè)新基因，位于染色體16q23.3-24.1。研究發(fā)現(xiàn)，多種癌細(xì)胞中出現(xiàn)WWOX外顯子5-8或6-8的異常轉(zhuǎn)錄

2、，提示W(wǎng)WOX是另一種具抑制腫瘤生長(zhǎng)的基因，在基因組和轉(zhuǎn)錄水平影響這個(gè)基因的異常可能與致癌性有關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)在乳腺癌、卵巢癌和非小細(xì)胞性肺癌中存在著WWOX的表達(dá)降低，WWOX基因在多種腫瘤組織及細(xì)胞系中出現(xiàn)頻發(fā)雜合性丟失、mRNA異常轉(zhuǎn)錄子及WWOX蛋白表達(dá)異常等證明WWOX屬于抑癌基因。 WWOX蛋白含有414個(gè)氨基酸，其氨基末端有兩個(gè)WW結(jié)構(gòu)域，而WW結(jié)構(gòu)域的功能主要與蛋白之間的相互作用有關(guān)。在WWOX蛋白的中心部位有一短鏈

3、氧化還原酶功能域(short-chain dehydrogenase/reductase domain，SRD)，SRD具有特異性酶的功能。因此，WWOX可能在雌二醇和雌激素受體相互作用的調(diào)節(jié)中發(fā)揮了作用。 抑癌基因在基因組和轉(zhuǎn)錄水平的異常表達(dá)是腫瘤發(fā)生的常見(jiàn)原因，WWOX基因失活機(jī)制可能有：①WWOX等位基因雜合子缺失及純合子缺失[4]；@WWOX基因mRNA轉(zhuǎn)錄缺失或嚴(yán)重降低，導(dǎo)致表達(dá)缺失或降低；③DNA調(diào)控區(qū)CpG島甲基化

4、。WWOX基因與脆性三聯(lián)組氨酸(FHIT)基因的mRNA表達(dá)有相關(guān)性[5]。文獻(xiàn)報(bào)道胰腺癌中WWOX基因的表達(dá)缺失與DNA調(diào)控區(qū)CpG島的甲基化有關(guān)。近年來(lái)腫瘤基因甲基化的研究之所以受到腫瘤研究者的重視，原因在于：(1)基因調(diào)控區(qū)域的CpG島的甲基化與各種基因(包括抑癌基因)表達(dá)的調(diào)控異常密切相關(guān)；(2)特異性CpG島的甲基化容易在癌癥患者個(gè)體以及高危人群的體液和組織中檢測(cè)到，因此特異性基因甲基化模式的研究有助于腫瘤診斷和預(yù)后預(yù)測(cè)；(3

5、)甲基化可以被特異性抑制劑所逆轉(zhuǎn)，提示這一類(lèi)型的抑制劑可以應(yīng)用于臨床治療。研究發(fā)現(xiàn)肼苯噠嗪能作為去甲基化藥物恢復(fù)T淋巴細(xì)胞功能相關(guān)抗原、誘導(dǎo)出P16基因啟動(dòng)子甲基化的乳腺癌細(xì)胞系的P16基因mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)[69]，在腫瘤治療中顯示出良好的應(yīng)用前景[71]。 本研究目的：①通過(guò)檢測(cè)乳腺癌和癌旁乳腺組織中WWOX蛋白的表達(dá)，并與ER、PR、HER-2/neu、絕經(jīng)狀態(tài)及臨床分期等臨床病理學(xué)指標(biāo)進(jìn)行分析；通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄酶聯(lián)聚合反應(yīng)(

6、RT-PCR)檢測(cè)乳腺癌MDA-MB-231、MCF-7細(xì)胞系以及乳腺癌標(biāo)本W(wǎng)WOX基因mRNA的表達(dá)；②應(yīng)用甲基化特異性PCR(methylation specific PCR，MSP)檢測(cè)乳腺癌中WWOX基因表達(dá)異常與DNA調(diào)控區(qū)(啟動(dòng)子及第一外顯子)CpG島甲基化狀態(tài)的關(guān)系；③應(yīng)用肼苯噠嗪對(duì)MDA-MB-231、MCF-7細(xì)胞進(jìn)行處理，以5-雜氮-2'-脫氧胞苷(5-aza-2'-deoxycytidine,5-Aza-CdR)作

7、為陽(yáng)性對(duì)照，觀察肼苯噠嗪對(duì)于WWOX基因CpG島去甲基化、mRNA表達(dá)及癌細(xì)胞增殖活性的作用。 現(xiàn)將主要內(nèi)容簡(jiǎn)要介紹如下。 第一部分乳腺癌WWoX蛋白表達(dá)及其臨床意義 目的:檢測(cè)乳腺癌組織及細(xì)胞株中WWOX蛋白表達(dá)，并分析其與ER、絕經(jīng)狀態(tài)及臨床分期等指標(biāo)間的關(guān)系。 方法:應(yīng)用免疫組織化學(xué)SP法檢測(cè)56例乳腺正常組織、12例DCIS和87例乳腺癌組織WWOX蛋白的表達(dá)，并與雌激素受體(ER)、孕激素受體(

8、PR)、HER-2/neu、絕經(jīng)狀態(tài)及腫瘤分期等臨床病理學(xué)資料進(jìn)行分析。應(yīng)用免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測(cè)MDA-MB-231、MCF-7細(xì)胞中WWOX蛋白的表達(dá)。 結(jié)果: 1.乳腺癌組織中WWOX蛋白表達(dá)顯著降低(62.1％)，與乳腺正常組織(28.6％)相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.001)； 2.乳腺癌組織WWOX表達(dá)缺失與ER狀態(tài)關(guān)系密切，39.2％的ER陰性病例和28.8％的ER陽(yáng)性病例中WWOX蛋白表達(dá)缺失，差異有統(tǒng)計(jì)

9、學(xué)意義(P：0.026)； 3.乳腺癌WWOX蛋白表達(dá)與絕經(jīng)狀態(tài)相關(guān)，20.3％的絕經(jīng)前病人和57.2％的絕經(jīng)后病人中WWOX蛋白表達(dá)缺失，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.003)； 4. 晚期乳腺癌病人WWOX表達(dá)降低或缺失的比例增高，Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ期病人中WWOX蛋白表達(dá)缺失的比例分別為23.1％、28.6％和46.2％，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.001)； 5.MDA-MB-231細(xì)胞WWOX蛋白染色明顯降低，而MC

10、F-7細(xì)胞呈現(xiàn)強(qiáng)染色： 6.WWOX蛋白表達(dá)與PR、HER-2/neu及腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等指標(biāo)的關(guān)系無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。 結(jié)論:乳腺癌中廣泛存在著WWOX蛋白的表達(dá)缺失，其異常表達(dá)與ER狀態(tài)、絕經(jīng)狀態(tài)和腫瘤臨床分期關(guān)系密切，提示W(wǎng)WOX基因可能通過(guò)激素受體信號(hào)途徑在乳腺癌的發(fā)生和發(fā)展中發(fā)揮作用。乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞WWOX蛋白低表達(dá)，而MCF-7細(xì)胞高表達(dá)。 第二部分乳腺癌組織和細(xì)胞株WWOX基

11、因調(diào)控區(qū)(啟動(dòng)子和第一外顯子)CpG島甲基化狀態(tài)的研究 目的:探討乳腺癌組織和MDA-MB-231、MCF-7細(xì)胞株中WWOX基因調(diào)控區(qū)(啟動(dòng)子和第一外顯子)CpG島甲基化狀態(tài)，并分析WWOX基因mRNA表達(dá)與CpG島甲基化狀態(tài)的關(guān)系。 方法:選取乳腺癌細(xì)胞株MDA-MB-23 1、MCF-7細(xì)胞、20例乳腺癌組織和10例癌旁組織為研究對(duì)象，通過(guò)WWOX基因DNA提取，應(yīng)用CpGcnomeDNA修正盒進(jìn)行DNA亞硝酸鹽修

12、飾，采用甲基化特異性PCR(methylation specificPCR,MSP)方法檢測(cè)乳腺癌組織和細(xì)胞系WWOX基因CpG島甲基化狀態(tài)；通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)技術(shù)檢測(cè)WWOX基因mRNA表達(dá)，探討WWOX基因CpG島甲基化與mRNA表達(dá)的關(guān)系。 結(jié)果: 1.乳腺癌癌旁組織WWOX基因DNA調(diào)控區(qū)CpG無(wú)甲基化條帶表達(dá)； 2.20例乳腺癌組織中，11例中出現(xiàn)WWOX基因啟動(dòng)子CpG島甲基化擴(kuò)增

13、，甲基化率為55％，其中4例為完全甲基化(僅甲基化引物擴(kuò)增出目的基因)，7例為部分甲基化(甲基化引物和非甲基化引物均擴(kuò)增出目的基因)。9例中出現(xiàn)WWOX基因第一外顯子CpG島甲基化擴(kuò)增，甲基化率為45％，其中4例為完全甲基化，5例為部分甲基化； 3.乳腺癌組織和癌旁組織中WWOX基因mRNA相對(duì)含量的平均值分別為1.18±0.11、2.1 4±0.12，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)； 結(jié)論:乳腺癌組織和細(xì)胞系存在著不

14、同程度的WWOX基因DNA調(diào)控區(qū)(啟動(dòng)子和外顯子)CpC；島甲基化，是導(dǎo)致WWOX基因表達(dá)缺陷的原因之一。WWOX基因調(diào)控區(qū)CpG島甲基化的乳腺癌組織WWOX mRNA表達(dá)明顯降低，提示DNA甲基化是乳腺癌WWOX基因mRNA表達(dá)缺陷的重要機(jī)制。 第三部分肼苯噠嗪對(duì)乳腺癌細(xì)胞WWOX基因CpG島去甲基化作用的實(shí)驗(yàn)研究 目的:探討肼苯噠嗪能否發(fā)揮去甲基化作用，誘導(dǎo)乳腺癌MDA-MB-231、MCF-7細(xì)胞 mRNA及蛋白表

15、達(dá)，并抑制細(xì)胞增殖。 方法:肼苯噠嗪處理MDA-MB-231、MCF-7細(xì)胞，以5-Aza-CdR作為陽(yáng)性對(duì)照，MSP檢測(cè)WWOX基因CpG甲基化狀態(tài)；RT-PCR分析藥物處理組、對(duì)照組WWOX因 mRNA及蛋白表達(dá)變化：采用細(xì)胞計(jì)數(shù)法繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線，噻唑藍(lán)(MTT)法測(cè)定細(xì)胞抑制率，分析肼苯噠嗪處理前后乳腺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)變化。 結(jié)論:肼苯噠嗪可以發(fā)揮去甲基化作用，誘導(dǎo)MDA-MB-231細(xì)胞WWOX基因mRNA及蛋白表

16、達(dá)，并抑制細(xì)胞增殖活性。1.0、2.0、4.0、6.0μmol/L等濃度的5-Aza-CdR處理MDA-MB-231細(xì)胞后，在去甲基化、恢復(fù)WWOX基因mRNA和蛋白表達(dá)以及降低癌細(xì)胞增殖等方面作用無(wú)顯著性差異。 乳腺癌中廣泛存在著WWOX基因的表達(dá)缺失，其異常表達(dá)與ER狀態(tài)、絕經(jīng)狀態(tài)和腫瘤臨床分期關(guān)系密切，提示W(wǎng)WOX基因可能是通過(guò)激素受體信號(hào)途徑在乳腺癌的發(fā)生和發(fā)展中發(fā)揮作用。乳腺癌組織中存在不同程度的WWOX基因啟動(dòng)子和第

17、一外顯子CpG島的完全甲基化和部分甲基化，且WWOX基因mRNA表達(dá)降低，提示CpG島甲基化是乳腺癌WWOX基因tuRNA表達(dá)缺陷的重要機(jī)制。MDA-MB-231細(xì)胞中，WWOX基因啟動(dòng)子和第一外顯子CpG存在著完全甲基化，WWOX基因mRNA及蛋白表達(dá)明顯降低。MCF-7細(xì)胞無(wú)WWOX基因CpG島甲基化，WWOX基因mRNA及蛋白高表達(dá)。10μmol/L肼苯噠嗪和1.0、2.0、4.0、6.0μmol/L的5-Aza-CdR對(duì)MDA-