乳腺癌多藥耐藥基因ABCG2表達(dá)與DNA甲基化研究.pdf

1、1.研究背景: 乳腺癌是危害婦女健康的主要惡性腫瘤，其發(fā)病率與死亡率有逐年上升趨勢(shì)。目前，手術(shù)是乳腺癌治療的主要手段，但化學(xué)藥物治療也是乳腺癌綜合治療一個(gè)不可缺少的重要方法，尤其晚期乳腺癌，可在術(shù)前、術(shù)中及術(shù)后進(jìn)行全身性或區(qū)域性輔助化學(xué)治療。然而，乳腺癌細(xì)胞對(duì)化療藥物易產(chǎn)生多藥耐藥(multidrug resistance，MDR)，即由一種藥物誘發(fā)，但同時(shí)又對(duì)其他多種結(jié)構(gòu)和作用機(jī)制迥異的抗癌藥物產(chǎn)生交叉耐藥，是影響藥物療效及病

2、人預(yù)后的主要原因。 腫瘤多藥耐藥存在多種機(jī)制，其中以ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白超家族(ATP—binding cassette transporter superfamily)成員介導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)藥物外排在MDR中起了重要作用，也是目前國(guó)內(nèi)外研究的熱點(diǎn)之一。該家族中與藥物耐受密切相關(guān)的蛋白有：由多藥耐藥基因MDR1 (multidrug resistance 1)所編碼ABCB1，又名P—糖蛋白(P—glycop rotein，P—gp)和AB

3、CC1，又名多藥耐藥相關(guān)蛋白(multidrug resistance p rotein，MRP1)，以及新近發(fā)現(xiàn)的由ABCG2基因編碼的乳腺癌耐藥蛋白(breast cancer resistance protein，BCRP)又名(ABCG2/MXP/ABCP)。 雖然ABCG2基因具有一定的生理功能，但其過(guò)表達(dá)?？山閷?dǎo)對(duì)米托蒽醌，拓?fù)涮婵担奔奏┻实鹊目拱┧幬锏哪褪?。研究表明，多藥耐藥基因ABCG2在乳腺癌中有表達(dá)，化療常

4、引起其過(guò)表達(dá)，導(dǎo)致多藥耐藥，影響了乳腺癌的治療療效及病人預(yù)后。目前，對(duì)該基因表達(dá)的分子機(jī)制尚不清楚?；蚪Y(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)，該基因啟動(dòng)子區(qū)存在多種轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)，并含有豐富的甲基化島及正性和負(fù)性調(diào)控區(qū)域。MDR1基因啟動(dòng)子區(qū)同樣存在豐富的甲基化島，且其表達(dá)與DNA甲基化密切相關(guān)，同時(shí)，有研究表明ABCG2表達(dá)與DNA甲基化有關(guān)，但在乳腺癌中的研究目前尚無(wú)。 因此，本研究擬用米托蒽醌染毒，以建立不同耐藥程度的MCF—7/Mit耐藥細(xì)胞

5、株，收集術(shù)前化療與未化療的乳腺癌組織標(biāo)本，進(jìn)行體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)研究，初步探討乳腺癌多藥耐藥ABCG2基因表達(dá)與DNA甲基化的關(guān)系，為逆轉(zhuǎn)由ABCG2蛋白引起的腫瘤多藥耐藥提供新的靶點(diǎn)，以提高腫瘤病人的化療療效，最終改善腫瘤病人的生存質(zhì)量。 2.方法: 2.1以終濃度為0.005，0.01，0.02，0.04，0.08μM的米托蒽醌，由低濃度開(kāi)始，對(duì)人乳腺癌細(xì)胞MCF—7持續(xù)染毒，并連續(xù)換次高濃度染毒。每個(gè)濃度持續(xù)染毒30天，誘

6、導(dǎo)細(xì)胞耐藥。觀察細(xì)胞形態(tài)變化，并繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。 2.2以未染毒的MCF—7為對(duì)照，用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)該不同染毒濃度MCF—7細(xì)胞對(duì)米托蒽醌的耐藥性，并用CCK—8法檢測(cè)其對(duì)米托蒽醌，阿霉素及肽素的耐受性。 2.3以免疫熒光，Q—PCR及WesternBlot方法檢測(cè)不同耐藥程度的MCF—7/Mit中ABCG2的表達(dá)。同時(shí)，用Q—PCR方法檢測(cè)4μM5-aza—dC染毒72h的MCF—7細(xì)胞中ABCG2mRNA表達(dá)，作為

7、陽(yáng)性對(duì)照。 2.4以高效毛細(xì)胞管電泳法檢測(cè)MCF—7/Mit耐藥細(xì)胞中全基因組甲基化水平，并通過(guò)甲基化特異性PCR(MSP)法檢測(cè)了ABCG2基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化狀況。用4μM5-aza—dC染毒72h的MCF—7細(xì)胞作為陽(yáng)性對(duì)照。 2.5以Q—PCR及WesternBlot方法檢測(cè)了MCF—7/Mit中DNMT1，DNMT3A及DNMT3B的表達(dá)水平。同時(shí)，以Q—PCR方法檢測(cè)用4μM5-aza—dC染毒72h的MCF—

8、7細(xì)胞作為陽(yáng)性對(duì)照。 2.6以Q—PCR檢測(cè)了術(shù)前化療與未化療的乳腺癌組織中ABCG2及DNMT1，DNMT3A和DNMT3BmRNA表達(dá)水平；MSP法檢測(cè)ABCG2啟動(dòng)子區(qū)甲基化狀況。 3.結(jié)果: 3.1初次染毒及初次換次高濃度的米托蒽醌染毒時(shí)，細(xì)胞死亡較多，細(xì)胞生長(zhǎng)緩慢。從低劑量到高劑量染毒，形態(tài)出現(xiàn)一定的變化，且細(xì)胞生長(zhǎng)相對(duì)緩慢。 3.2隨著米托蒽醌染毒劑量的增加，MCF—7細(xì)胞的耐藥性增大；對(duì)米托

9、蒽醌的耐藥性最大，對(duì)阿霉素和肽素的耐藥性相似。以0.02μM階段組MCF—7細(xì)胞變化開(kāi)始明顯。 3.3ABCG2蛋白主要表達(dá)于細(xì)胞膜上，且隨MCF—7/Mit耐藥性的增加，表達(dá)增加，并在0.02階段組ABCG2表達(dá)變化開(kāi)始顯著。 3.4與未染毒的MCF—7細(xì)胞相比，MCF—7/Mit細(xì)胞中全基因組呈低甲基化趨勢(shì)，選定的ABCG2啟動(dòng)子區(qū)個(gè)別位點(diǎn)呈高甲基化趨勢(shì)。 3.5MCF—7/Mit耐藥細(xì)胞株中，DNMT1，D

10、NMT3A及DNMT3B表達(dá)呈降低趨勢(shì)，以DNMT3B變化最明顯，DNMT1次之。 3.6以術(shù)前未化療的乳腺癌組織為對(duì)照，術(shù)前化療的乳腺癌組織中，ABCG2mRNA呈高表達(dá)趨勢(shì)；所選定的ABCG2啟動(dòng)子區(qū)個(gè)別位點(diǎn)呈高甲基化趨勢(shì)；DNMT1，DNMT3A及DNMT3B呈低表達(dá)趨勢(shì)，以DNMT3B表達(dá)變化明顯。 4.結(jié)論: (1)本實(shí)驗(yàn)室已成功構(gòu)建了不同耐藥程度的MCF—7/Mit耐藥細(xì)胞株，為ABCG2蛋白介導(dǎo)耐藥