PCR技術(shù)檢測藻類16SrDNA特異性片段在溺死診斷中的應(yīng)用.pdf

1、目的：本研究主要通過酶消化法聯(lián)合MoBio強(qiáng)力土壤DNA提取試劑盒(PowerSoilTM DNA Isolation Kit)提取藻類DNA，可直接用于下游實(shí)驗(yàn);選用針對藍(lán)藻、硅藻、綠藻等多種藻類特異性引物，擴(kuò)增藻類16SrDNA中V3，V4區(qū)特異性片段，通過聚丙烯酰胺凝膠電泳及PCR產(chǎn)物測序，驗(yàn)證引物特異性。微波消解-真空抽濾-電鏡掃描法是一種可靠的靈敏度高、特異性強(qiáng)的硅藻形態(tài)學(xué)檢驗(yàn)方法，檢測溺死樣本具有較高的陽性率，但在檢驗(yàn)的過程

2、中破壞了藍(lán)藻、綠藻的溺死相關(guān)藻類。本研究使用針對多種隨溺液進(jìn)入體循環(huán)的溺死相關(guān)藻類16SrDNA的特異性引物，檢測微波消解-真空抽濾-電鏡掃描法檢測過的案例樣本，并與微波消解-真空抽濾-電鏡掃描法檢測結(jié)果作比較，希望通過聯(lián)合使用兩種方法在水中尸體樣本中發(fā)現(xiàn)多種溺死相關(guān)藻類，為溺死診斷提供新的思路。本研究同時(shí)應(yīng)用毛細(xì)管電泳檢測溺死相關(guān)藻類16SrDNA基因，由于毛細(xì)管電泳法應(yīng)用廣泛、操作簡單，在溺死鑒定中易普及推廣，希望為溺死診斷提供一種

3、新方法。
　　方法：實(shí)驗(yàn)材料(1)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物樣本35只實(shí)驗(yàn)兔隨機(jī)分為3組:生前入水組(溺死組)15只，死后入水組（空氣栓塞致死后入水）15只，以及對照組（空氣栓塞死后不作處理）5只;(2)水中尸體樣本共64份包括20例微波消解-真空抽濾-自動(dòng)電鏡掃描法檢測水中尸體硅藻陽性樣本（58份樣本，其中肺臟、肝臟、腎臟樣本分別為18、20、20份），6份微波消解-真空抽濾-自動(dòng)電鏡掃描法檢驗(yàn)的水中尸體陰性肝臟樣本，同時(shí)記錄案例樣本的腐敗程度。

4、(3)引物特異性驗(yàn)證樣本7種已知溺死相關(guān)的藻類（直鏈藻、菱形藻、針桿藻、舟形藻，銅綠微囊藻，小環(huán)藻，小球藻）及白色念珠菌（真菌）、肉毒梭狀芽孢桿菌（細(xì)菌）樣本，人基因組DNA、兔基因組DNA，用于驗(yàn)證引物特異性。
　　DNA提取使用酶消化法與PowerSoilTM DNA Isolation Kit試劑盒提取組織樣本（實(shí)驗(yàn)兔、人體案例組織），水樣中的藻類DNA及引物特異性驗(yàn)證樣本DNA。
　　PCR產(chǎn)物的檢測及檢驗(yàn)方法的比較

5、(1)使用PCR-聚丙烯酰氨凝膠電泳法(PCR-PAGE)檢測各組實(shí)驗(yàn)兔臟器中溺死相關(guān)藻類DNA，比較3組實(shí)驗(yàn)兔各臟器之間藻類檢出率(2)使用PCR-毛細(xì)管電泳法(PCR-CE)檢測溺死組實(shí)驗(yàn)兔臟器中溺死相關(guān)藻類，比較PCR-PAGE與PCR-CE兩種方法在檢測溺死組實(shí)驗(yàn)兔PCR產(chǎn)物陽性率，記錄并比較兩種電泳方法檢測PCR產(chǎn)物電泳過程中電泳前準(zhǔn)備時(shí)間、電泳后結(jié)果分析時(shí)間，同時(shí)比較兩種方法檢測PCR產(chǎn)物的各自特點(diǎn);(3)PCR-CE檢測收

6、集的微波消解-真空抽濾-電鏡掃描法檢測的水中尸體臟器硅藻陽性樣本共58份，6份水中尸體硅藻陰性肝臟樣本，同時(shí)記錄每份樣本中硅藻數(shù)量，將PCR-CE法與微波消解法結(jié)果進(jìn)行比較。
　　結(jié)果：實(shí)驗(yàn)兔樣本結(jié)果:
　　PCR-PAGE法檢測3組實(shí)驗(yàn)兔生前入水組肺檢出率最高，肝、腎檢出率次之，分別為100％，86％，86％;實(shí)驗(yàn)兔死后入水組肺、肝、腎檢出率分別為13％，0％，0％;對照組肺、肝、腎藻類未檢出。PCR-PAGE法檢測生前入

7、水組與死后入水組各種臟器中藻類檢出率經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)差異顯著(P＜0.05)。
　　PCR-CE法檢測溺死組實(shí)驗(yàn)兔肺臟、肝臟、腎臟藻類檢出率分別為100％，86％，86％，PCR-PAGE與PCR-CE法檢測溺死組實(shí)驗(yàn)兔結(jié)果相比，兩者在肺臟、肝臟、腎臟之間具有相同的陽性率，不具統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);PCR-CE法與PCR-PAGE法檢測PCR產(chǎn)物在電泳前準(zhǔn)備用時(shí)及電泳結(jié)果后分析用時(shí)相比，明顯少于PAGE電泳法(P＜0.05)，且

8、操作更加方便、簡潔，處理多份樣本有較好優(yōu)勢，結(jié)果容易儲存。
　　水中尸體樣本藻類檢出率結(jié)果:PCR-CE法檢測經(jīng)微波消解-真空抽濾-電鏡掃描法檢測過的20例共58份水中尸體硅藻陽性樣本藻類檢出率分別為:肺臟檢出率最高為100％，肝，腎次之，分別為60％，60％。PCR-CE法在腎臟、肝臟樣本的藻類檢出率與微波消解-真空抽濾-電鏡掃描法（肺、肝、腎均為100％）相比，兩種方法陽性率比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)，即微波消解-真空

9、抽濾-電鏡掃描法陽性率明顯高于PCR-CE法，其中PCR-CE法檢測腐敗程度較高的肝臟、腎臟樣本中不易檢出藻類DNA;兩種方法在肺臟之間藻類檢出率不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05);通過對PCR-CE法檢測的部分陽性樣本進(jìn)行測序表明，在硅藻含量較少的一些樣本中同時(shí)存在藍(lán)藻。PCR-CE法檢測微波消解-真空抽濾-電鏡掃描法檢測后6份硅藻檢驗(yàn)為陰性樣本1份新鮮檢材藻類檢測為陽性，測序結(jié)果顯示為藍(lán)藻。
　　引物特異性檢測結(jié)果:PAGE法檢

10、測7種溺死相關(guān)藻類DNA（直鏈藻、菱形藻、針桿藻、舟形藻，銅綠微囊藻，小環(huán)藻，小球藻）檢測結(jié)果為陽性;檢測人基因組DNA、兔基因組DNA，白色念珠菌（真菌）DNA，肉毒梭狀芽孢桿菌（細(xì)菌）DNA均為陰性。
　　結(jié)論：實(shí)驗(yàn)兔結(jié)果表明PCR-PAGE法檢測溺死相關(guān)藻類16SrDNA基因片段可以區(qū)分生前入水和死后入水;2例死后入水組實(shí)驗(yàn)兔肺臟中檢測結(jié)果為陽性可能由于水的壓力作用下經(jīng)呼吸道進(jìn)入肺臟中所致，因此只有肺臟中含有藻類時(shí)，對于進(jìn)行

11、溺死診斷要謹(jǐn)慎。
　　PCR-PAGE與PCR-CE法檢測溺死實(shí)驗(yàn)兔結(jié)果相比，雖然兩者具有相同的陽性率，但實(shí)驗(yàn)過程中PCR-CE法與PCR-PAGE法檢測PCR產(chǎn)物相比，電泳前準(zhǔn)備時(shí)間及電泳后結(jié)果分析時(shí)間均較為省時(shí)，且操作更加方便、簡潔，結(jié)果容易儲存等優(yōu)點(diǎn)，對于處理多份樣本有較好的優(yōu)勢。
　　對20例水中尸體樣本研究結(jié)果表明，較新鮮的檢材使用PCE-CE法檢測溺死相關(guān)藻類易檢出，而腐敗較為嚴(yán)重的檢材不易檢出，導(dǎo)致本方法檢測案

12、例尸體臟器樣本中肝臟、腎臟中的藻類檢出率低于微波消解-真空抽濾-電鏡掃描法。使用PCE-CE法檢測水中尸體案例樣本研究表明，對一些水中尸體案例樣本中硅藻檢測數(shù)量含量較少（通過微波消解-真空抽濾-電鏡掃描法檢測記錄臟器中硅藻數(shù)量）的樣本，也含有其它的溺死相關(guān)藻類如藍(lán)藻（通過對PCR-CE法檢測為陽性的樣本進(jìn)行產(chǎn)物測序）。因此，通過PCR技術(shù)檢測多種溺死相關(guān)藻類同時(shí)聯(lián)合微波消解-真空抽濾-電鏡掃描法檢驗(yàn)硅藻，有望為溺死的診斷提供可靠的信息，