特異性卵黃抗體活性片段的制備及性能研究.pdf

1、特異性卵黃抗體，即卵黃免疫球蛋白(ImmunoglobulinYolk，IgY)，在防治由細(xì)菌或病毒感染引起的動(dòng)物性疾病方面具有安全無殘留、不產(chǎn)生抗藥性、特異性強(qiáng)等特點(diǎn)，已引起研究者的廣泛關(guān)注。有研究表明，口服的特異性IgY（在消化道黏液的作用下易被分解）在不與病原菌直接接觸的情況下，對(duì)細(xì)菌感染引起的非消化道疾病起到了顯著的治療作用，據(jù)此，研究者推測(cè)IgY在體內(nèi)可能以活性片段的形式與病原菌特異性結(jié)合，抑制病原菌在病灶處的定植與繁殖，從而

2、發(fā)揮治療疾病的作用。本研究分別采用體外酶解法和基因工程重組表達(dá)法制備特異性IgY活性片段，向其中加入熒光識(shí)別位點(diǎn)，以期借助體內(nèi)熒光示蹤技術(shù)考察特異性IgY活性片段在體內(nèi)的走向及分布，從而為研究口服特異性IgY治療非消化道疾病的作用機(jī)理提供實(shí)驗(yàn)材料和理論依據(jù)。
　　體外酶解法采用嗜水氣單胞菌滅活疫苗免疫蛋雞，制備IgY及其活性片段。間接ELISA表明，IgY的最高效價(jià)可達(dá)1∶51200;經(jīng)兩步鹽析，IgY的純度由原來的30.5％提高

3、到62.2％。免疫熒光和體外抑菌實(shí)驗(yàn)表明，特異性IgY與嗜水氣單胞菌的結(jié)合為特異性結(jié)合。胃蛋白酶酶解IgY的SDS-PAGE和間接ELISA顯示，胃蛋白酶作用于IgY24h能夠?qū)gY徹底分解成Fab'和pFc'碎片;Westernblot和體外抑菌實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明特異性IgY酶解組分中的Fab'為IgY活性片段，其具有顯著的體外抑菌性能。
　　基因工程重組表達(dá)法以金黃色葡萄球菌為抗原，免疫蛋雞，采集血液，合成cDNA，根據(jù)Geneb

4、ank報(bào)道的雞IgY可變框架區(qū)的序列分別設(shè)計(jì)IgY重、輕鏈可變區(qū)引物，PCR釣取IgY重、輕鏈可變區(qū)基因，基因測(cè)序，結(jié)果表明，重鏈可變區(qū)的片段大小約為390bp;輕鏈可變區(qū)均約為330bp。采用生物信息學(xué)方法對(duì)所得序列與現(xiàn)已報(bào)道的相關(guān)基因序列進(jìn)行比較，初步篩選出4條特異性IgY可變區(qū)序列，VH2和VH7及VL1和VL4，分別連接pET28a載體，構(gòu)建重組菌，IPTG誘導(dǎo)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)VH2和VH7的誘導(dǎo)表達(dá)成功，且在EcoliBL21中的表

5、達(dá)均為胞內(nèi)可溶性表達(dá);與對(duì)照組相比，VH2和VH7均具有顯著地結(jié)合金黃色葡萄球菌的能力，且VH7的抗原結(jié)合活性顯著高于VH2(P＜0.05)。采用體外酶解法制備的特異性IgY酶解組分中含非特異組分，這將會(huì)干擾后續(xù)實(shí)驗(yàn)，因此，本研究更傾向于用基因工程重組表達(dá)法制備特異性IgY活性片段。
　　綜上，酶解法制備的特異性IgY酶解組分中具有體外抑菌活性和抗原結(jié)合活性的活性片段為Fab';基因工程重組表達(dá)法成功表達(dá)出兩個(gè)特異性IgY活性片段