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文檔簡介
1、根據(jù)我國法律,未經(jīng)安全評價(jià)的油菜產(chǎn)品不容許進(jìn)口和在我國種植。進(jìn)入產(chǎn)業(yè)化的轉(zhuǎn)基因品種需要建立檢測和監(jiān)測方法。2004年,我國允許拜耳公司研發(fā)的6個(gè)轉(zhuǎn)基因油菜品種(MS1×RF1、MS1×RF2、MS8×RF3、OXY235、Topas19/2和T45)和孟山都公司研發(fā)的1個(gè)轉(zhuǎn)基因油菜品種RT73(GT73)作為加工原料進(jìn)口。對轉(zhuǎn)基因油菜及其產(chǎn)品進(jìn)行檢測和監(jiān)測是實(shí)施轉(zhuǎn)基因油菜安全管理的關(guān)鍵。隨著轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的定量標(biāo)識(shí)制度出臺(tái),轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品定性、
2、定量檢測方法的研究顯得十分迫切和重要。本實(shí)驗(yàn)以德國拜耳公司培育的6個(gè)轉(zhuǎn)基因品種(MS1×RF1、MS1×RF2、MS8×RF3、OXY235、Topas19/2和T45)為實(shí)驗(yàn)材料,采用基因組步移法研究了轉(zhuǎn)基因油菜品系MS1、RF1、RF2、MS8、RF3、OXY235、Topas19/2和T45的外源基因插入位點(diǎn)序列特征,并根據(jù)插入DNA與基因組DNA的融合序列信息建立了MS1、RF1、RF2、MS8、RF3、OXY235、Topas
3、19/2和T45轉(zhuǎn)化事件特異性定性、定量檢測方法。并且對每個(gè)檢測體系的特異性、靈敏度、重復(fù)性、準(zhǔn)確性及可靠性進(jìn)行了驗(yàn)證。 1.MS1右邊界(5'端)旁側(cè)序列片段大小為1165bp,特異性引物MS1RG/MS1RV擴(kuò)增片段大小為141bp,檢測靈敏度為2.5個(gè)拷貝(0.013%),建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線決定系數(shù)R2值為0.995,LOD(limitofdetection)和LOQ(limitofquantification)分別為2.5個(gè)
4、拷貝和25個(gè)拷貝。 2.RF1左右邊界(3'和5'端)旁側(cè)序列片段大小分別為1592bp、3192bp,定性引物RF1RG/RF1RV和RF1LG-F/RF1LV-R擴(kuò)增片段大小為99bp、284bp,檢測靈敏度均為5個(gè)拷貝(0.013%),定量引物RF1RG/RF1RV和RF1LG/RF1LV擴(kuò)增片段大小為99bp、117bp,建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線決定系數(shù)R2值分別為0.996和0.988,LOD值均為5個(gè)拷貝;LOQ為25個(gè)拷貝。
5、 3.RF2右邊界(5'端)旁側(cè)序列片段大小為2978bp,特異性引物對RF2RG/RF2RV擴(kuò)增片段大小為138bp,檢測靈敏度為5個(gè)拷貝(0.013%),建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線決定系數(shù)R2值為0.998,LOD和LOQ分別為5個(gè)拷貝和25個(gè)拷貝。 4.MS8右邊界(3'端)旁側(cè)序列片段大小為907bp,特異性引物Ms8RG/Ms8RV擴(kuò)增片段大小為123bp,檢測靈敏度為2.5個(gè)拷貝(0.013%),建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線決定系數(shù)R
6、2值為0.991,LOD和LOQ分別為20個(gè)拷貝和25個(gè)拷貝。 5.RF3右邊界(3'端)旁側(cè)序列片段大小為694bp,特異性引物Rf3RG/Rf3RV擴(kuò)增片段大小為92bp,檢測靈敏度為50個(gè)拷貝(0.13%),建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線決定系數(shù)R2值為0.995,LOD和LOQ分別為20個(gè)拷貝和25個(gè)拷貝。 6.OXY235左右邊界(5'和3'端)旁側(cè)序列片段大小分別為923bp、1109bp,特異引物OXYLG/OXYLV和O
7、XYRG/OXYRV擴(kuò)增片斷大小發(fā)分別為105bp,124bp,檢測靈敏度分別是100個(gè)拷貝(0.13%)和10個(gè)拷貝(0.013%)。建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線決定系數(shù)R2分別為1.000和0.998,LOD值均為10個(gè)拷貝或接近10個(gè)拷貝;LOQ值均為50個(gè)拷貝。 7.Topas19/2左邊界(3'端)旁側(cè)序列片段大小為823bp,特異性引物TOPLG/TOPLV擴(kuò)增片段大小為110bp,檢測靈敏度為10個(gè)拷貝(0.013%),建立的標(biāo)
8、準(zhǔn)曲線決定系數(shù)R2值為0.995,LOD和LOQ分別為5個(gè)拷貝和50個(gè)拷貝。 8.T45左右邊界(3'端和5'端)旁側(cè)序列片段大小分別為2154bp、1616bp,根據(jù)分離的左右邊界(3'端和5'端)設(shè)計(jì)特異引物T45LG/T45LV和T45RG/T45RV,擴(kuò)增片斷大小分別為107bp,117bp。用根據(jù)右邊界(5'端)設(shè)計(jì)的引物對T45RG/T45RV擴(kuò)增低拷貝模板時(shí),熒光信號(hào)迅速衰減。選用引物對T45LG/T45LV建立定
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