利用iTRAQ技術(shù)篩查神經(jīng)管畸形產(chǎn)前診斷的分子標(biāo)志物及其在畸形發(fā)生過(guò)程中作用機(jī)制研究.pdf

1、目的：
　　神經(jīng)管畸形(neural tube defects，NTDs)是兒童常見(jiàn)的畸形，在中國(guó)的發(fā)病率較西方國(guó)家高，發(fā)病率為1‰-5‰[1]。該病由環(huán)境因素和遺傳因素共同作用所致[2]，其畸形的發(fā)病機(jī)制并不清楚，治療效果不佳。雖然口服葉酸可以降低50-70％的發(fā)病率，但目前仍然沒(méi)有完全預(yù)防和治愈的方法[3]。70-80％的神經(jīng)管畸形可能通過(guò)產(chǎn)前篩查手段如超聲及孕婦血清AFP篩查出來(lái)[4]，但目前AFP等產(chǎn)前檢查標(biāo)記物的特異性并

2、不高[5]。因此，特異的標(biāo)志物的發(fā)現(xiàn)可以提高產(chǎn)前診斷，并為神經(jīng)管的早期治療提供線(xiàn)索。
　　孕期胎兒和孕婦之間存在相互交換，其交換物質(zhì)包括細(xì)胞內(nèi)、細(xì)胞外因子如激素，生長(zhǎng)因子和粘附分子，免疫調(diào)節(jié)因子等[6-8]。母體的生理過(guò)程適應(yīng)胎兒的生長(zhǎng)發(fā)育，胎兒作為內(nèi)分泌器官產(chǎn)生大量的蛋白質(zhì)進(jìn)入母體和胎兒循環(huán)[9，10]。正常妊娠期，在母體循環(huán)中可以發(fā)現(xiàn)大量的母體和胎兒產(chǎn)生的物質(zhì)。因此母體胎兒循環(huán)標(biāo)志物的識(shí)別有助于產(chǎn)前診斷或預(yù)后的標(biāo)志物發(fā)現(xiàn)，并幫

3、助更好的了解潛在的發(fā)病機(jī)制[11-13]。病理情況下孕早期循環(huán)標(biāo)志物可以在臨床癥狀發(fā)展之前作為潛在的診斷標(biāo)志物，而孕后期標(biāo)志物的檢測(cè)可能與疾病的真正表型緊密相關(guān)。孕婦血清生化組成成分隨懷孕周期不斷變化，血清蛋白譜變化能夠反應(yīng)孕婦和胎兒的生理和病理變化。因此研究孕婦血清蛋白譜變化規(guī)律對(duì)畸形早期發(fā)現(xiàn)和研究畸形發(fā)生機(jī)制具有十分重要的意義。
　　本研究應(yīng)用維甲酸在大鼠神經(jīng)管閉合的關(guān)鍵期(E10)給藥，建立脊柱裂大鼠模型，應(yīng)用蛋白質(zhì)組學(xué)iT

4、RAQ/質(zhì)譜分析方法，比較致畸早期孕11、13天正常組孕鼠和顯性脊柱裂孕鼠血清蛋白表達(dá)譜的變化，并采用ELISA方法、real-timeRT-PCR方法、Western-blot方法、免疫組化方法，在基因水平和蛋白水平觀(guān)察在不同胚胎發(fā)育期脊柱裂組和對(duì)照組孕鼠血清、羊水、胎盤(pán)、胚胎脊髓中差異蛋白質(zhì)LIFR、PCSK9的表達(dá)情況，揭示LIFR、PCSK9在不同胚胎發(fā)育期的時(shí)空表達(dá)規(guī)律，以探討其在脊柱裂發(fā)生過(guò)程中的作用，為闡明脊柱裂的發(fā)病機(jī)制

5、提供理論依據(jù)。并在神經(jīng)管畸形及正常孕婦中檢測(cè)不同孕周PCSK9的變化，以篩查神經(jīng)管畸形相關(guān)血清標(biāo)記物。
　　方法：
　　一、動(dòng)物模型建立與標(biāo)本收集
　　成熟未孕Wistar大鼠，雌雄比例5∶1午夜合籠，晨8-9時(shí)陰道涂片，顯微鏡下見(jiàn)到精子記為E0，E10時(shí)維甲酸致畸組以140mg/kg用量經(jīng)胃管注入;對(duì)照組給予同體積的橄欖油。分別于E11、E12、E13、E15、E17心臟穿刺取血，剖宮取出胎鼠，解剖顯微鏡下辨認(rèn)畸形類(lèi)

6、型。血標(biāo)本用無(wú)抗凝劑的5ml普通采血試管，室溫放置2h，使血液凝固析出血清，3000g離心20min，分裝，-80℃保存。新鮮的羊水，12000 g離心15分鐘，4℃，以去除羊水中不可溶的雜質(zhì)，分裝，-80℃儲(chǔ)存。取出胎鼠脊髓、胎盤(pán)，-80℃保存或4％多聚甲醛固定。
　　NTD孕婦血清及正常孕婦血清、NTD胎兒及正常胎兒組織樣本采集自中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院及沈陽(yáng)市婦女兒童保健中心，各樣本入組均按孕周、孕婦年齡、收集時(shí)間匹配。NT

7、D胎兒均經(jīng)由超聲診斷。
　　二、iTRAQ分析
　?。ㄒ唬悠返闹苽?br>　　每個(gè)樣品精確取出100μ g蛋白。按蛋白∶酶=20∶1的比例加入Trypsin，37℃酶解4h。按上述比例再補(bǔ)加Trypsin一次，37℃繼續(xù)酶解8h。
　?。ǘ﹊TRAQ標(biāo)記
　　胰蛋白酶消化后，用真空離心泵抽干肽段。用0.5M TEAB復(fù)溶肽段，按照手冊(cè)進(jìn)行iTRAQ標(biāo)記，室溫培養(yǎng)2小時(shí)。將標(biāo)記后的各組肽段混合，用SCX柱進(jìn)行液

8、相分離。
　?。ㄈ㏒CX分離
　　采用島津LC-20AB液相系統(tǒng)、分離柱為4.6×250mm型號(hào)的UltremexSCX柱對(duì)樣品進(jìn)行液相分離。將標(biāo)記后抽干的混合肽段用4ml buffer A(25mM NaH2PO4 in25％ACN，pH2.7)復(fù)溶。進(jìn)柱后以1 ml/min的速率進(jìn)行梯度洗脫:先在5％ buffer B(25mM NaH2PO4，1M KCl in25％ACN，pH2.7)中洗脫7min，緊跟著一個(gè)20

9、min的直線(xiàn)梯度使buffer B由5％上升至60％，最后在2min內(nèi)使buffer B的比例上升至100％并保持1min，然后恢復(fù)到5％平衡10min。整個(gè)洗脫過(guò)程在214nm吸光度下進(jìn)行監(jiān)測(cè)，經(jīng)過(guò)篩選得到12個(gè)組分。每個(gè)組分分別用StrataX除鹽柱除鹽，然后冷凍抽干。
　?。ㄋ模┗赥riple TOF5600的LC-ESI-MSMS分析
　　將抽干的每個(gè)組分分別用buffer A(5％ ACN，0.1％FA)復(fù)溶至約

10、0.5μg/μl的濃度，20000g離心10min，除去不溶物質(zhì)。每個(gè)組分上樣5μl（約2.5μ g蛋白），通過(guò)島津公司LC-20AD型號(hào)的納升液相色譜儀進(jìn)行分離。所用的柱子柱包括Trap柱和分析柱兩部分。分離程序如下：先以8μl/min的流速在4min內(nèi)將樣品loading到Trap柱上，緊接著一個(gè)總流速為300nl/min的分析梯度將樣品帶入分析柱，分離并傳輸至質(zhì)譜系統(tǒng)。先在5％buffer B(95％ACN，0.1％FA)下洗脫5

11、min，跟著一個(gè)35min的線(xiàn)性梯度使buffer B的比例由5％上升至35％，在接下來(lái)的5min內(nèi)提高到60％，然后在2min內(nèi)buffer B增加到80％并保持2min，最后在1min內(nèi)恢復(fù)至5％并在此條件下平衡10min。
　　（五）數(shù)據(jù)分析
　　質(zhì)譜分析結(jié)果使用和Mascot(version2.3.02)數(shù)據(jù)查詢(xún)軟件。在大鼠數(shù)據(jù)庫(kù)IPI_rat_v3.87（共39925條序列）中查詢(xún)，本項(xiàng)目鑒定過(guò)程中，各參數(shù)選擇如下

12、：變量修飾為Gln-＞pyro-Glu(N-term Q)，Oxidation(M)，iTRAQ8plex(Y)，固定修飾為Carbamidomethyl(C)，iTRAQ8plex(N-term)，iTRAQ8plex(K)，允許一個(gè)胰酶漏切點(diǎn)(trypsin miscleavage)，基于數(shù)據(jù)庫(kù)搜索策略的肽段匹配誤差控制在0.05Da以下，碎片質(zhì)量誤差±0.1Da。對(duì)鑒定的肽段置信度大于95％，significance scores

13、(≥20)。定量分析時(shí)，鑒定的蛋白需要包含至少兩個(gè)不同的肽段，當(dāng)?shù)鞍椎呢S度比即差異倍數(shù)達(dá)到1.5倍以上，且經(jīng)統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)其p-value值小于0.05時(shí)，視該蛋白為不同樣品間的差異蛋白。我們將iTRAQ鑒定出的所有蛋白和所有的差異蛋白進(jìn)行生物信息學(xué)分析。
　　三、ELISA方法驗(yàn)證iTRAQ分析發(fā)現(xiàn)的差異蛋白質(zhì)
　　每組各取6例孕鼠血清，加樣、酶標(biāo)抗體孵育、底物顯色、終止反應(yīng)、酶標(biāo)儀OD值檢測(cè)、根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)計(jì)算濃度，具體操作按試

14、劑盒說(shuō)明書(shū)嚴(yán)格執(zhí)行，驗(yàn)證iTRAQ分析發(fā)現(xiàn)的差異蛋白質(zhì)。并檢測(cè)不同時(shí)間點(diǎn)(E11、13、15、17)孕鼠血清和羊水中LIFR、PCSK9濃度，同時(shí)在不同孕周NTDs及正常孕婦血清中檢測(cè)PCSK9水平。
　　結(jié)果：
　　一、先天性脊柱裂大鼠模型
　　維甲酸140mg/kg給藥成功制作先天性脊柱裂大鼠動(dòng)物模型，共剖檢孕鼠(E11、E12、E13、E15、E17)130只。維甲酸致畸孕鼠54只，共獲得胎鼠285只，其中脊柱裂

15、胎鼠175只，無(wú)畸形胎鼠110只（致畸率61.4％）;對(duì)照組孕鼠60只，共獲得正常胎鼠200只。
　　二、iTRAQ分析結(jié)果
　　在本次質(zhì)譜實(shí)驗(yàn)中共得到譜圖157422張，通過(guò)Mascot軟件進(jìn)行分析后，匹配到的譜圖數(shù)量是7303張，其中Unique譜圖數(shù)量為6013張，共鑒定到390個(gè)蛋白，2167個(gè)肽段，其中含1880個(gè)Unique肽段。當(dāng)?shù)鞍棕S度差異倍數(shù)達(dá)到1.5倍以上，且經(jīng)統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)其p-value值小于0.05時(shí)，視

16、為差異蛋白，共發(fā)現(xiàn)E11天維甲酸致畸組與正常對(duì)照組差異蛋白40種，E13天維甲酸致畸組與正常對(duì)照組差異蛋白26種，E11天與E13天正常對(duì)照組差異蛋白48種，E11天與E13天維甲酸致畸組差異蛋白38種。
　　在差異蛋白中，維甲酸致畸組與正常對(duì)照組比較，蛋白APOM，PCSK9在E11天和E13天同時(shí)下調(diào)，蛋白FGG, Uncharacterized在E11天和E13天同時(shí)上調(diào)，蛋白PLA2g2a，F(xiàn)GI2，SERPINE2，TU

17、BB5，F(xiàn)G11，HP在E11天下調(diào)而E13天上調(diào)。
　　結(jié)論：
　　1、篩選出致畸早期大量神經(jīng)管畸形和正常孕鼠血清差異蛋白質(zhì)，其分子功能以結(jié)合、催化、轉(zhuǎn)運(yùn)活性為主，大部分蛋白參與生物調(diào)節(jié)、細(xì)胞、代謝過(guò)程，COG注釋差異蛋白主要參與蛋白質(zhì)翻譯后修飾、折疊、分子伴侶和細(xì)胞骨架功能，差異蛋白通過(guò)直接或間接地相互作用，促進(jìn)或者抑制神經(jīng)管畸形的發(fā)生與發(fā)展。
　　2、孕婦血清PCSK9水平神經(jīng)管畸形組較正常組顯著下調(diào)，ROC曲線(xiàn)