遺傳性并多指家系的致病基因分析及產(chǎn)前診斷.pdf

1、并多指(synpolydactyly，SPD，MIM18600，syndactylytypeⅡ)是一種以肢端發(fā)育異常為主要特征的遺傳性疾病，多呈常染色體顯性遺傳。其典型臨床表現(xiàn)為3/4手指和4/5腳趾受累，兩指（趾）間由蹼相連，不能分離，并指的蹼中可合并有骨性多指，且常伴有第5趾外端的多趾，第5指的側(cè)彎、屈曲和短指，第2-5趾可有不同程度的并趾，中節(jié)趾骨發(fā)育不全等。受累肢體可為1-4個(gè)，受累程度可由單純的皮膚相連到完全性骨性融合，甚至累

2、及掌骨或跖骨。
　　 目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)有SPD1、SPD2和SPD3三種SPD，致病基因分別定位于2q31，22q13.31和14q11.2-q12，其中，SPD1的致病基因?yàn)槲挥谌旧w2q31的HOXD13。HOXD13是HOX家族的成員之一，編碼轉(zhuǎn)錄因子，在肢體發(fā)育中具有重要作用。典型的SPD由位于HOXD13基因N末端的15個(gè)聚丙氨酸殘基的延伸所致。基因型和表型的相關(guān)性分析表明，聚丙氨酸區(qū)域短的延伸（如7個(gè)）與較低的外顯率和表

3、現(xiàn)度有關(guān)，而較長(zhǎng)的聚丙氨酸延伸（如10個(gè)或更多）則導(dǎo)致較高的外顯率和更嚴(yán)重的表型。而且，HOXD13同源結(jié)構(gòu)域內(nèi)的缺失和錯(cuò)義突變也可導(dǎo)致非典型的SPD，如特定的足部表型、短指合并并指畸形或者D型和E型短指。
　　 為SPD的高危妊娠進(jìn)行產(chǎn)前診斷可以避免SPD患兒出生。迄今為止，僅有幾例SPD的產(chǎn)前診斷報(bào)道。本研究中，我們利用在山東省濟(jì)南市采集到的SPD家系，對(duì)其臨床特點(diǎn)及系譜特征進(jìn)行了分析，對(duì)其致病原因進(jìn)行了分子遺傳學(xué)研究，確定

4、了致病基因及致病突變，并且在此基礎(chǔ)上為家系高危妊娠提供了影像學(xué)和分子遺傳學(xué)產(chǎn)前診斷。
　　 第一部分，一個(gè)常染色體顯性遺傳并多指家系的家系調(diào)查及臨床分析
　　 在遺傳咨詢(xún)過(guò)程中，我們發(fā)現(xiàn)了一SPD患者，因面臨生育前來(lái)咨詢(xún)并申請(qǐng)產(chǎn)前診斷。為了明確該SPD家系患者的致病基因，我們首先對(duì)該SPD家系進(jìn)行了家系調(diào)查及臨床分析。
　　 家系調(diào)查發(fā)現(xiàn)，家系中共有成員41名，其中患者16例，受累患者均表現(xiàn)有典型的并多指（趾）畸

5、形。家系中男女均有發(fā)病，5代中共有男性患者9名，女性患者7名。家系中連續(xù)5代均有患者，在連續(xù)世代中呈垂直分布，無(wú)隔代遺傳現(xiàn)象。家系中患者均存在不同程度的并（多）指（趾），但患者間存在較大的表現(xiàn)度差異。通過(guò)系譜分析，該SPD家系的遺傳方式為常染色體顯性遺傳。
　　 該SPD家系中受累患者均表現(xiàn)有典型的并多指（趾）畸形。先證者出生時(shí)即發(fā)現(xiàn)嚴(yán)重手足畸形，表現(xiàn)為3/4指完全并指，4/5趾并趾并伴有多趾。經(jīng)過(guò)詳細(xì)的臨床調(diào)查，該SPD家系臨

6、床特點(diǎn)總結(jié)如下:①先天性發(fā)病;②嚴(yán)重程度不同，家系中患者有表現(xiàn)度差異;③手部畸形嚴(yán)重，影響手部功能的發(fā)揮;④主要表現(xiàn)為3/4指完全并指，4/5趾并趾并伴有多趾;⑤X線檢查有并多指（趾）表現(xiàn);⑥呈常染色體顯性遺傳。根據(jù)典型的臨床特征及放射線檢查和系譜分析結(jié)果，可以確診此家系患者為Ⅱ型并指，SPD1型，A4亞型。
　　 第二部分，并多指家系的致病基因分析
　　 獲得家系成員的系譜特征及標(biāo)本后，為確定該家系致病基因，我們首先將

7、HOXD13基因作為候選基因，在候選基因的兩側(cè)選取緊密連鎖的STR位點(diǎn)D2S1238和D2S1245進(jìn)行連鎖分析。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳分析后確定家系中各個(gè)體基因型，經(jīng)基因型分析和單體型分析發(fā)現(xiàn)，該家系致病基因與HOXD13緊密連鎖，提示HOXD13弛是該家系的致病基因。
　　 隨后，我們應(yīng)用PCR擴(kuò)增結(jié)合測(cè)序分析檢測(cè)HOXD13基因突變。首先我們分析了最常見(jiàn)的Poly-A突變。對(duì)包含該位點(diǎn)的第1外顯子進(jìn)行PCR擴(kuò)增

8、后，回收純化目的片段進(jìn)行TA克隆，挑選單克隆擴(kuò)增后進(jìn)行測(cè)序分析。測(cè)序結(jié)果采用BLAST程序進(jìn)行序列對(duì)比分析。發(fā)現(xiàn)先證者的HOXD13基因在cDNA的189-190bp之間插入27bp，該插入突變使聚丙氨酸重復(fù)序列的第14和第15個(gè)丙氨酸之間插入9個(gè)丙氨酸殘基，導(dǎo)致poly-A鏈的延伸。
　　 為證實(shí)該突變?cè)诩蚁抵信c疾病表型共分離，我們采用PCR擴(kuò)增結(jié)合變性聚丙烯酰胺凝膠電泳方法確定家系中各成員的基因型，發(fā)現(xiàn)所有患者都帶有27bp

9、插入突變，正常人無(wú)此突變，證實(shí)該突變?yōu)榧蚁祷颊叩闹虏⊥蛔儭?br>　　 第三部分，并多指家系的產(chǎn)前診斷
　　 SPD屬于一類(lèi)嚴(yán)重致殘致畸的單基因遺傳性疾病，開(kāi)展基因和超聲學(xué)產(chǎn)前診斷，防止患兒出生是預(yù)防該病發(fā)生的最佳應(yīng)對(duì)策略和最有效方法。為此，根據(jù)咨詢(xún)者要求，我們?cè)诩蚁捣治龊突蛐头治龌A(chǔ)上，聯(lián)合應(yīng)用超聲產(chǎn)前診斷檢查方法和分子診斷方法對(duì)該家系中的1例高危妊娠進(jìn)行產(chǎn)前影像學(xué)和分子遺傳學(xué)診斷。
　　 孕16周起，通過(guò)超聲進(jìn)行

10、四肢動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)，動(dòng)態(tài)觀察胎兒手足形態(tài);并于孕18周經(jīng)腹抽取SPD孕婦的羊水，提取羊水中胎兒細(xì)胞基因組DNA，通過(guò)D2S1238和D2S1245兩個(gè)STR位點(diǎn)連鎖分析及HOXD13基因突變檢測(cè)完成了對(duì)該家系的產(chǎn)前基因診斷，為家系成員提供了準(zhǔn)確的產(chǎn)前診斷結(jié)果。新生兒出生時(shí)行體格檢查進(jìn)行驗(yàn)證。
　　 本部分結(jié)果顯示，超聲產(chǎn)前診斷未發(fā)現(xiàn)胎兒肢體異常。胎兒DNA連鎖分析結(jié)果表明胎兒從母親得到的是與正常等位基因連鎖的等位基因，表明胎兒未從其母