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文檔簡介
1、第一部分,研究背景:先天性畸形存在于接近100%的新生兒中,潛在致命的先天性畸形的發(fā)生率為2%-3%,是新生兒生后1年內(nèi)死亡的主要原因。其發(fā)病的重要原因是染色體的不平衡。目前經(jīng)典的細胞遺傳學(xué)分析方法一染色體核型分析和熒光原位雜交(fluorescent in situ hybridization,F(xiàn)ISH)在研究染色體畸變方面起了重要作用。這兩種方法非常有效,但是也存在明顯的局限性。細胞遺傳學(xué)方法容易因為外部污染、培養(yǎng)失敗或母體細胞的選
2、擇性生長導(dǎo)致誤差。FISH技術(shù)應(yīng)用的探針并不適用于所有染色體不平衡的產(chǎn)前篩查,只局限于染色體特定區(qū)域。1992年,Kallioniemi等創(chuàng)建比較基因組雜交(Comparative GetaomicHybridization,CGH)技術(shù),其基本原理是采用等量的患者基因組DNA(標記為綠色)、正?;蚪MDNA(標記為紅色)作為探針,并用Cot-1 DNA抑制分散重復(fù)序列,將三者混合后與正常人的中期染色體鋪片進行雜交。根據(jù)兩種DNA探針的
3、熒光信號強度差異來判斷待測基因組中DNA的增加或缺失區(qū)域。 目的:建立方便實用的CGH方法路線,對通過超聲檢查確診畸形后引產(chǎn)的胎兒或畸形新生兒進行非整倍體篩查,以檢驗該方法的敏感性和可靠性,并應(yīng)用于產(chǎn)前診斷,以提高圍產(chǎn)兒優(yōu)生率。 方法:研究組選取于2006年7月-2007年1月在山東省立醫(yī)院婦產(chǎn)科引產(chǎn)的畸形胎兒5例,宮內(nèi)死亡胎兒1例,出生后發(fā)現(xiàn)畸形新生兒3例。入選病例均在產(chǎn)前檢查時經(jīng)B超確診畸形或出生時發(fā)現(xiàn)2種以上的畸形
4、,涉及心血管系統(tǒng)、中樞神經(jīng)系統(tǒng)、骨骼系統(tǒng)或泌尿生殖系統(tǒng),留取5-10ml羊水或2-5ml防凝臍帶血;對照組采用我院健康查體中心就診的身體健康的男性及女性各1名,抽取清晨空腹肘靜脈血2ml防凝。采用Tiangen公司的DNA抽提試劑盒提取基因組DNA,紫外分光光度計測定DNA濃度和純度,Vys i s缺口平移試劑盒標記待測DNA和對照DNA,每份樣本均分別標記SpectrumGreen和SpectrumRed。反應(yīng)條件為15℃作用0.5h
5、-1h以獲得最佳DNA片段(300-3000bp)。將等量的SpectrumGreen標記的待測DNA、SpectrumRed標記的正常對照:DNA與足量的人Cot-1 DNA混勻,醋酸鈉乙醇沉淀DNA,CGH雜交緩沖液重懸制成混合探針,加至正常中期染色體玻片的雜交區(qū)域,73℃共變性,封片后放入密閉濕盒,37℃孵育箱中雜交48-72小時。在74℃預(yù)熱的0.4XSSC/0.3%NP-40溶液中洗片3-6秒,晾干后放入室溫的2XSSC/0.
6、1%NP-40溶液中洗片1-3秒,DAPI II復(fù)染。使用配備有CCD照相機和DAPI、SpectrumGreen和SpectrumRecl濾光片的熒光顯微鏡進行中期染色體分裂相的選擇、攝像。熒光互換CGH:將待測DNA和對照DNA的熒光顏色互換,即SpectrumRed標記待測DNA、SpectrumGreen標記正常對照DNA,二者混勻,其余實驗步驟同上述。使用CGH軟件進行圖像分析,選擇5-10個雜交信號光滑,背景較低,著絲粒、異
7、染色質(zhì)區(qū)域標記探針結(jié)合較少以及DAPI帶型較好的中期染色體,根據(jù)綠紅兩種信號的比值,分析每一染色體上的熒光強度比(fluoresterme intensity ratio,F(xiàn)R),即可制作CGH拷貝數(shù)核型模式圖,以1.0表示平衡比例。過高或過低的FR閾值可能會導(dǎo)致假陰性或假陽性結(jié)果,因此我們將FR閾值定為1.25和0.75,三體或染色體片段的擴增定義為FR>1.25,1.5以上視為高水平擴增;單體或染色體片段的缺失定義為FR<0.75。
8、 結(jié)果:9例畸形胎兒/新生兒均成功的利用CGH方法進行了分析。其中病例4、8、9檢測出染色體的不平衡并通過熒光互換CGH得到了確認。病例4的基因組DNA標記為綠色時,CGH核型為Dup 21,但在熒光互換CGH中僅檢測到了21q的擴增。由于Cot-1。DNA抑制了標記的DNA與著絲粒和異染色質(zhì)區(qū)域的雜交且每個個體在此區(qū)域差異較大,以及端粒處的熒光強度會下降至與背景熒光相似,所以這些區(qū)域一般都不在CGH分析范圍之內(nèi)。因此病例4的C
9、GH核型為Dup 21q;病例8的CGH核型為Del 2p24-pter,Dup 12p13并通過熒光互換CGH得到證實;病例9在排除了22p異染色質(zhì)區(qū)域的雜交偏移后,其CGH核型為Del 1p33-pter,Del 22q11-12。其余病例的檢測結(jié)果未發(fā)現(xiàn)染色體缺失或擴增。 結(jié)論:熒光互換CGH能夠減小在DNA標記和雜交過程中出現(xiàn)的偏移,在經(jīng)典的細胞遺傳學(xué)分析方法不可行時增加非整倍體病例檢出的準確性和可靠性,可替代染色體顯帶
10、技術(shù)用于非整倍體的篩查。 第二部分,研究背景:唐氏綜合征又稱21三體綜合征或先天愚型,是由于21號染色體異常而表現(xiàn)為智力中重度低下、特殊面容及各種先天性畸形的綜合征,群體發(fā)病率為1.23‰,占先天智力障礙的50%,在染色體畸變及與先天畸形有關(guān)的染色體疾病中位居首位。因患兒的出生給家庭和社會帶來眾多不良影響,且目前尚無有效治療方法,因此只有進行早期診斷,終止妊娠,降低患兒的出生率,才能達到優(yōu)生的目的。唐氏綜合征的產(chǎn)前篩查包括孕婦血
11、清標志物的篩查和超聲檢查。多項血清標記物聯(lián)合應(yīng)用篩查唐氏綜合征,結(jié)合孕婦的年齡、孕周、體重及超聲監(jiān)測,通過相應(yīng)軟件進行計算,得到胎兒唐氏綜合征的發(fā)病風(fēng)險系數(shù),對高危孕婦行羊膜腔穿刺取材、細胞遺傳學(xué)方法進行產(chǎn)前診斷。羊水細胞培養(yǎng)和染色體G顯帶分析成功率高,是目前產(chǎn)前診斷的“金標準”。STR是目前應(yīng)用最廣泛的遺傳標記,具有高度多態(tài)性和雜合性,聯(lián)合應(yīng)用PCR技術(shù)同時擴增21號染色體的多個STR標志,只要有一個標志出現(xiàn)三峰或三條帶,即可做出唐氏
12、綜合征的診斷。STR-PCR方法敏感,所需DNA量少,可用妊娠早期乃至中、晚期羊水獲取胎兒細胞DNA,實驗周期短,操作簡便,安全性高,還可做到幾十個標本同時進行,為開展大規(guī)模的產(chǎn)前檢測提供了技術(shù)保障。 目的:利用21號染色體上多個STR多態(tài)性分析快速檢測胎兒是否唐氏綜合征患兒,陽性病例采用比較基因組雜交檢測,與傳統(tǒng)的染色體核型分析結(jié)果進行比較,確認該方法的應(yīng)用價值。 方法:選擇2006年8月-2006年12月在山東省立醫(yī)
13、院和濟南市婦幼保健院行唐氏綜合征篩查結(jié)果為高風(fēng)險的需進行羊膜腔穿刺的孕婦79例,胎兒畸形、死胎或新生兒畸形的孕婦9例作為研究對象。唐氏綜合征篩查結(jié)果為高風(fēng)險的孕婦:行羊膜腔穿刺抽取羊水28-30ml,25ml羊水離心后按常規(guī)實驗室方法進行羊水細胞培養(yǎng)作染色體分析,剩余3-5ml羊水離心后留取沉淀;發(fā)現(xiàn)胎兒畸形、死胎的孕婦在行利凡諾羊膜腔內(nèi)注射時留取羊水5-10ml,離心后留取沉淀;畸形新生兒產(chǎn)時留取臍帶血2-5ml。采用Tiangen公
14、司的DNA抽提試劑盒提取基因組DNA,紫外分光光度計測定DNA濃度和純度。選擇21號染色體的7個STR位點D21S1432、D21S1414、D21S1413、D21S1437、D21$2039、D21S11和D21S1446來檢測胎兒是否罹患唐氏綜合征;選擇X和Y染色體所共有但長度序列有所不同的Amelogenin基因來確定胎兒性別。每份樣本分8管進行,PCR反應(yīng)條件如下:DNA反應(yīng)體系20 μl,10×Buffer 2 μl、2.5
15、 mM dNTP 1.6 μl、5 μM上下游引物各2 μl、HS-Taq酶0.1μl、DNA模板n μl(0.05 μg,根據(jù)基因組DNA濃度計算獲得)、ddH<,2>O(12.3-n)μl。循環(huán)參數(shù)為:94℃預(yù)變性3 min;94℃變性30s,58℃退火30s,72℃延伸30s,5個循環(huán);94℃變性30s,52℃退火30s,72℃延伸30s,30個循環(huán);72℃后延伸5 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳確定PCR擴增效果,根
16、據(jù)8號管PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果確定胎兒性別。1-7號管的PCR產(chǎn)物用10%聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測7個位STR點的帶型,以確定是否為唐氏綜合征患兒。經(jīng)過21號染色體7個STR位點分析結(jié)果為21三體的樣本,用比較基因組雜交方法進行核型分析,與細胞遺傳學(xué)分析結(jié)果進行比較。 結(jié)果:3-5ml羊水中提取的DNA濃度為0.0386±0.0139μg/μl,最小值為0.0225μg/μl,提取的DNA最少為1.125 μg;9例畸形胎兒或新生兒的
17、羊水或臍帶血標本中提取的DNA總量是4-15.65μg,足夠8管PCR反應(yīng)及CGH實驗所需。88例樣本中男性39例,女性49例;檢測出2例21三體,其中1餅(35號樣本)來自唐氏綜合征篩查高危的孕婦,7個STR位點中D21S1413、D21S2039表現(xiàn)為3條帶,CGH核型為Dup 21,細胞遺傳學(xué)分析結(jié)果為47,XY,+21;另1例(X4號樣本)伴有胎兒心血管系統(tǒng)畸形和外觀畸形,7個8TR位點中D21S1437、D21S2039、D2
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