Fip200siRNA-DNA納米材料調(diào)控肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞生長(zhǎng)及機(jī)制研究.pdf

1、肺動(dòng)脈高壓[1](Pulmonary arterial hypertension，PAH)是以肺血管阻力進(jìn)行性升高為特征的一組疾病，常伴有右心室的肥厚及擴(kuò)張，致殘率及病死率高，除了傳統(tǒng)的藥物治療外，基因治療、活體肺移植等新的治療手段逐漸出現(xiàn)，但仍嚴(yán)重威脅人類健康。其中缺氧引起的肺動(dòng)脈高壓，多由慢性阻塞性肺疾病、支氣管擴(kuò)張等疾病引起。肺血管重構(gòu)[2](Pulmonary vascular remodeling，PVR)學(xué)說(shuō)認(rèn)為低氧條件下，

2、肺動(dòng)脈中存在的肺血管內(nèi)皮細(xì)胞及肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞(Pulmonary arterial smooth muscle cells，PASMCs)的異常增殖及凋亡。自噬作為細(xì)胞內(nèi)維持穩(wěn)態(tài)的重要途徑，在肺血管重構(gòu)中有重要調(diào)節(jié)作用[3]。目前，肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞在肺血管重構(gòu)中的自噬的改變尚不十分明確。Fip200作為重要的自噬基因，通過(guò)研究Fip200在肺血管重構(gòu)中的作用，有望為PAH的機(jī)制研究找到新方向。
　　納米技術(shù)作為新興技術(shù)在醫(yī)學(xué)醫(yī)用

3、領(lǐng)域有寬闊前景，特別是作為運(yùn)載載體，能高效轉(zhuǎn)運(yùn)藥物。小RNA作為重要的RNA，能調(diào)控基因的表達(dá)，是基因治療的重要方法，但因其運(yùn)載方式受限，影響其進(jìn)一步應(yīng)用。將基因治療與納米技術(shù)融合，可改善小RNA的轉(zhuǎn)運(yùn)問(wèn)題。DNA納米材料有別于傳統(tǒng)的脂質(zhì)體、病毒、高分子聚合物等傳統(tǒng)的納米材料，可利用DNA雜交原理，實(shí)現(xiàn)自組裝，簡(jiǎn)單、可控，且本身具有無(wú)毒、無(wú)免疫源性的特點(diǎn)[4]。核酸適配體是以核酸為基礎(chǔ)，能特意識(shí)別細(xì)胞的物質(zhì)。因此，設(shè)計(jì)轉(zhuǎn)載核酸適配體的自

4、組裝DNA納米材料，為基因治療建立運(yùn)載平臺(tái)。
　　因此，設(shè)計(jì)了一種由三種DNA單鏈攜帶Fip200siRNA，通過(guò)DNA-RNA雜交技術(shù)，組裝成的新型三角板材料。通過(guò)凝膠電泳，驗(yàn)證其合成效率。通過(guò)RT-PCR及Westernblot檢測(cè)其對(duì)目的基因的干擾作用，研究低氧條件下Fip200在肺血管平滑肌異常增殖及凋亡中的作用，以及低氧條件下Fip200對(duì)于TGF-β通路的作用。
　　目的：
　　1.合成一種新型的攜帶siR

5、NA的DNA三角板運(yùn)載體，檢測(cè)其對(duì)在PASMCs中的轉(zhuǎn)運(yùn)效率。
　　2.研究低氧條件下Fip200對(duì)PASMCs的增殖、凋亡及表型轉(zhuǎn)化的影響。
　　3.探討低氧條件下Fip200影響PASMCs的增殖、凋亡及表型轉(zhuǎn)化的機(jī)制。
　　方法：
　　1.DNA自組裝三角板納米材料的構(gòu)建及其轉(zhuǎn)運(yùn)效率的研究。
　　(1)構(gòu)建攜帶Fip200siRNA的DNA三角板納米材料，通過(guò)凝膠電泳檢測(cè)其產(chǎn)率，通過(guò)激光共聚焦及流式細(xì)

6、胞術(shù)檢測(cè)其轉(zhuǎn)染效率。
　　(2)使用RT-PCR及Westernblot檢測(cè)攜帶Fip200siRNA的DNA三角板納米材料對(duì)PASMCs細(xì)胞中Fip200基因表達(dá)的干擾效果。
　　2.培養(yǎng)大鼠肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞，檢測(cè)低氧條件下PASMCs增殖凋亡的改變及Fip200siRNA對(duì)其影響。
　　(1)使用Westernblot檢測(cè)低氧條件下PASMCs增殖、凋亡及自噬的改變。
　　(2)采用流式細(xì)胞術(shù)及MTT檢測(cè)Fi

7、p200siRNA對(duì)低氧條件下PASMCs增殖、凋亡的影響。
　　(3)使用WB檢測(cè)Fip200siRNA對(duì)PASMCs細(xì)胞中TGF-β的影響。
　　結(jié)果：
　　1.構(gòu)建了攜帶Fip200siRNA的DNA三角板納米材料，并轉(zhuǎn)載了PASMCs的核酸適配體，通過(guò)非變性凝膠電泳，驗(yàn)證其自組裝的效率。
　　2.通過(guò)WB及RT-PCR的方法，驗(yàn)證攜帶Fip200siRNA的DNA三角板納米材料對(duì)于PASMCs中Fip20

8、0的抑制效率，明顯降低了目的基因在mRNA及蛋白水平的表達(dá)。
　　3.低氧條件下，PASMCs存在增殖的高表達(dá)及凋亡的低表達(dá)狀態(tài)，并存在高水平自噬的狀態(tài)。
　　4.攜帶Fip200siRNA的DNA三角板納米材料轉(zhuǎn)染PASMCs后，有效的抑制了低氧條件下的自噬，并且抑制了細(xì)胞的增殖，促進(jìn)了細(xì)胞的凋亡。
　　5.低氧條件下，F(xiàn)ip200siRNA下調(diào)了TGF-β通路，其可能與對(duì)細(xì)胞增殖及凋亡影響有關(guān)。
　　結(jié)論：<