自組裝siRNA-DNA納米管構(gòu)建及其調(diào)節(jié)肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞自噬作用的研究.pdf

1、基因治療在疾病治療中具有巨大的應(yīng)用潛力，研究可以傳遞各種目的基因的載體是納米醫(yī)學(xué)最重要的研究課題之一。目前，已經(jīng)報(bào)道了許多藥物傳遞載體，如高分子聚合物、陽(yáng)離子脂質(zhì)體、各種納米材料、病毒衣殼等。這些傳遞系統(tǒng)的有效性已被證實(shí)，然而其大部分為外源性物質(zhì)，缺乏組織特異性且具有潛在毒性。隨著DNA分子自組裝納米技術(shù)的發(fā)展，自組裝DNA納米結(jié)構(gòu)在生物學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用變成現(xiàn)實(shí)。DNA分子的優(yōu)勢(shì)在于其穩(wěn)定性，易生物降解，與其它的藥物傳遞材料相比，DNA分子

2、對(duì)于人體具有天然性、無(wú)免疫原性、無(wú)毒等優(yōu)點(diǎn)。大量研究顯示，自組裝DNA納米結(jié)構(gòu)可以用于細(xì)胞內(nèi)的貨物傳遞。并且，DNA納米結(jié)構(gòu)可以依據(jù)需遞送的信號(hào)分子、緩釋需要或者靶向配體等因素進(jìn)行結(jié)構(gòu)的優(yōu)化。因此，自組裝DNA納米材料是理想的遞送平臺(tái)。
　　肺動(dòng)脈高壓（Pulmonary arterial hypertension，PAH）嚴(yán)重威脅人類健康，患者5年生存率只有60％。低氧誘導(dǎo)肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞(Pulmonary arterial

3、smooth muscle cells，PASMCs)異常增殖和凋亡抵抗導(dǎo)致的肺血管重構(gòu)(Pulmonary vascular remodeling，PVR)是肺動(dòng)脈高壓發(fā)生的重要病理生理基礎(chǔ)。自噬是一種廣泛存在于哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的保守的、維持細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)的機(jī)制。最近的研究證實(shí)，其在肺血管疾病，如肺動(dòng)脈高壓、慢性阻塞性肺疾病的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮著重要作用。然而，自噬在肺動(dòng)脈高壓血管重構(gòu)過程中，特別是在肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞生物學(xué)效應(yīng)的影響尚不十分清

4、楚。故深入研究自噬在低氧誘導(dǎo)PASMCs增殖中的作用與機(jī)制，從而進(jìn)一步闡明低氧致肺血管重構(gòu)的分子機(jī)制，可望為防治PAH提供新的靶點(diǎn)及策略。
　　鑒于此，我們?cè)O(shè)計(jì)研發(fā)了一種以四條DNA單鏈自組裝的DNA納米管，并結(jié)合DNA-RNA雜交技術(shù)將功能基因mTOR siRNA以特定的比例組裝進(jìn)入納米管結(jié)構(gòu)。研究分析其有效性，并深入探討其對(duì)常氧或低氧條件下大鼠PASMCs自噬與增殖的影響。研究結(jié)論將進(jìn)一步完善低氧致肺血管重構(gòu)的分子機(jī)制，有望為

5、肺高壓等血管重構(gòu)性疾病的防治提供新的理論依據(jù)和策略。
　　目的:
　　自組裝攜帶mTOR siRNA的DNA納米管，分析其有效性，并研究其對(duì)RPASMCs自噬和增殖的影響。
　　方法:
　　1.自組裝攜帶mTOR siRNA的DNA納米管(siRNA-NTs)及其特性研究
　　(1)采用序列對(duì)稱性原理，三臂星形模塊方案自組裝攜帶mTOR siRNA的DNA納米管;
　　(2)通過凝膠電泳，原子力顯微鏡

6、分析、表征DNA納米管的結(jié)構(gòu);
　　2.攜帶mTOR siRNA的DNA納米管在RPASMCs的攝取及轉(zhuǎn)染效率觀察
　　體外培養(yǎng)來源于SD大鼠的肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞(RPASMCs)，由siRNA-NTs轉(zhuǎn)染RPASMCs;應(yīng)用激光共聚焦顯微鏡觀察RPASMCs對(duì)不同濃度的siRNA-NTs的攝取以及同一濃度不同時(shí)間點(diǎn)的攝取情況;流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)siRNA-NTs在RPASMCs的轉(zhuǎn)染效率及細(xì)胞內(nèi)攝取平均熒光強(qiáng)度;通過激光共聚焦觀

7、察DNA納米管在RPASMCs的內(nèi)吞進(jìn)程。
　　3.攜帶mTOR siRNA的DNA納米管對(duì)常氧下RPASMCs自噬作用的研究
　　由siRNA-NTs轉(zhuǎn)染RPASMCs，激光共聚焦顯微鏡觀察siRNA-NTs對(duì)RPASMCs自噬的影響;透射電鏡對(duì)比觀察siRNA-NTs誘導(dǎo)RPASMCs自噬的細(xì)胞超微結(jié)構(gòu);RT-PCR檢測(cè)siRNA-NTs轉(zhuǎn)染RPASMCs后mTOR mRNA的表達(dá);Western blot檢測(cè)siRNA

8、-NTs轉(zhuǎn)染RPASMCs后，p-mTOR、T-mTOR、LC3B和PACN的表達(dá);MTT法檢測(cè)siRNA-NTs對(duì)RPASMCs生長(zhǎng)抑制作用的濃度及時(shí)間依賴性。
　　4.攜帶mTOR siRNA的DNA納米管對(duì)低氧下RPASMCs自噬作用的研究
　　由siRNA-NTs轉(zhuǎn)染RPASMCs，低氧處理。激光共聚焦顯微鏡觀察siRNA-NTs對(duì)低氧下RPASMCs自噬的影響;Western blot檢測(cè)siRNA-NTs轉(zhuǎn)染RP

9、ASMCs后，p-mTOR、LC3B和PACN的表達(dá)變化;MTT、3H-TdR檢測(cè)siRNA-NTs轉(zhuǎn)染RPASMCs后，對(duì)細(xì)胞活力及增殖的影響。
　　結(jié)果:
　　1.納米材料的構(gòu)建和表征分析。(1)成功自組裝攜帶mTOR siRNA的DNA納米管(siRNA-NTs);(2)非變性PAGE膠分析、表征其產(chǎn)率高、結(jié)構(gòu)穩(wěn)定;(3)原子力顯微鏡掃描顯示，DNA納米管粒子粒度分布均勻。
　　2.細(xì)胞攝取攜帶mTOR siRN

10、A的DNA納米管具有劑量及時(shí)間依賴的特點(diǎn)。(1)激光共聚焦顯微鏡觀察細(xì)胞攝取siRNACy3-NTs具有劑量及時(shí)間依賴性，隨劑量及轉(zhuǎn)染孵育時(shí)間的增加，細(xì)胞內(nèi)紅色熒光顆粒逐漸增多，且當(dāng)濃度為50 nM及孵育12-24 h達(dá)到較高的細(xì)胞內(nèi)攝取(P＜0.05)。并顯著強(qiáng)于單獨(dú)的siRNA對(duì)照組(P＜0.05)(2)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示細(xì)胞攝取siRNACy3-NTs具有劑量及時(shí)間依賴性，隨劑量及轉(zhuǎn)染孵育時(shí)間的增加，細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率逐漸升高，且當(dāng)

11、濃度為50 nM及轉(zhuǎn)染孵育12-24 h達(dá)到較高的轉(zhuǎn)染效率(P＜0.05）。同時(shí)，細(xì)胞內(nèi)攝取的平均熒光密度也具有劑量及時(shí)間依賴性，且顯著強(qiáng)于單獨(dú)的siRNA組（P＜0.05）。上述結(jié)果提示自組裝的siRNA-DNA納米管結(jié)構(gòu)可以有效促進(jìn)其攜帶的mTOR siRNA轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)入RPASMCs內(nèi)，同時(shí)穩(wěn)定釋放。(3)激光共聚焦觀察siRNACy3-NTs納米粒子在細(xì)胞的內(nèi)吞進(jìn)程，結(jié)果顯示Cy3紅色熒光標(biāo)記的攜帶mTOR siRNA的DNA納米管

12、隨時(shí)間延長(zhǎng)逐漸從胞膜進(jìn)入胞質(zhì)，并定位于內(nèi)涵體。
　　3.攜帶mTOR siRNA的DNA納米管系統(tǒng)影響肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞自噬和增殖。(1)激光共聚焦圖像顯示紅色熒光標(biāo)記的siRNACy3-NTs與綠色標(biāo)記的細(xì)胞內(nèi)自噬小體位于同一區(qū)域。(2) mTOR siRNA誘導(dǎo)肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞自噬。激光共聚焦圖像顯示siRNA-NTs組細(xì)胞內(nèi)可見大量標(biāo)記自噬小體的綠色熒光，且顯著強(qiáng)于對(duì)照組及單獨(dú)的siRNA組(P＜0.05），甚至明顯強(qiáng)于雷帕霉

13、素組（陽(yáng)性對(duì)照組）(P＜0.05)。透射電鏡圖像顯示:siRNA-NTs組細(xì)胞內(nèi)可見大量自噬小體聚集，明顯多于對(duì)照組及單獨(dú)的納米管及siRNA組。Westernblot結(jié)果及半定量分析顯示siRNA-NTs組LC3BⅡ/Ⅰ蛋白表達(dá)顯著強(qiáng)于單獨(dú)的siRNA組及單獨(dú)的納米管組(P＜0.05)。(3)攜帶mTOR siRNA的DNA納米管通過抑制mTOR信號(hào)增強(qiáng)LC3B蛋白表達(dá)。RT-PCR結(jié)果顯示mTOR mRNA表達(dá)抑制具有劑量及時(shí)間依賴

14、性。且當(dāng)濃度為50 nM及轉(zhuǎn)染孵育48 h達(dá)到較高的抑制率(P＜0.05)。Westernblot結(jié)果顯示p-mTOR及T-mTOR蛋白表達(dá)抑制具有時(shí)間依賴性，孵育48h、72h的mTOR蛋白水平明顯低于24h(P＜0.05)。Westernblot結(jié)果顯示LC3BⅡ/Ⅰ蛋白表達(dá)隨mTOR蛋白表達(dá)抑制而升高，且于48h達(dá)到最高峰，相反，PCNA蛋白表達(dá)隨mTOR蛋白表達(dá)抑制而下降。提示通過下調(diào)mTOR表達(dá)，誘導(dǎo)細(xì)胞自噬，抑制增殖。(4)

15、 MTT檢測(cè)結(jié)果顯示:攜帶mTOR siRNA的DNA納米管以濃度及時(shí)間依賴的方式抑制細(xì)胞生長(zhǎng)。
　　4.mTOR信號(hào)調(diào)節(jié)低氧誘導(dǎo)的細(xì)胞自噬和增殖。(1)攜帶mTOR siRNA的DNA納米管促進(jìn)低氧誘導(dǎo)的細(xì)胞自噬。激光共聚焦圖像顯示siRNA-NTs組細(xì)胞內(nèi)可見大量標(biāo)記自噬小體的綠色熒光，且顯著強(qiáng)于低氧對(duì)照組及單獨(dú)siRNA組。Westernblot結(jié)果顯示低氧組LC3BⅡ/Ⅰ蛋白表達(dá)較常氧組升高(P＜0.05），siRNA-N

16、Ts組LC3BⅡ/Ⅰ蛋白表達(dá)明顯強(qiáng)于其它各組(P＜0.05）。(2)攜帶mTOR siRNA的DNA納米管抑制低氧誘導(dǎo)的細(xì)胞增殖。MTT結(jié)果顯示:siRNA-NTs組細(xì)胞活力明顯下降，且顯著低于低氧下其它各組(P＜0.05)。[3H]TdR結(jié)果顯示:siRNA-NTs組細(xì)胞增殖較低氧對(duì)照組明顯下降，且明顯低于單獨(dú)的siRNA組(P＜0.05）。(3)mTOR調(diào)節(jié)低氧誘導(dǎo)的LC3B及PCNA蛋白表達(dá)。Westemblot結(jié)果顯示siRNA

17、-NTs組抑制p-mTOR及PCNA蛋白表達(dá)，同時(shí)升高LC3B蛋白表達(dá)水平。提示抑制mTOR表達(dá)，可以誘導(dǎo)細(xì)胞自噬，導(dǎo)致細(xì)胞自噬性死亡，進(jìn)而抑制細(xì)胞增殖。
　　結(jié)論:
　　1.成功自組裝攜帶mTOR siRNA的DNA納米管，該納米管粒子結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，通過內(nèi)吞途徑進(jìn)入細(xì)胞，其細(xì)胞轉(zhuǎn)染和攝取呈時(shí)間和劑量依賴性。
　　2.攜帶mTOR siRNA的DNA納米管顯著抑制常氧和低氧下肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞中mTOR的表達(dá)，進(jìn)而誘導(dǎo)細(xì)胞自