抵抗素樣分子-β調(diào)控FAK信號傳導(dǎo)通路促進(jìn)人肺動脈血管平滑肌細(xì)胞增殖的機制研究.pdf

1、第一部分抵抗素樣分子-β刺激下黏著斑激酶、生存素在人肺動脈血管平滑肌細(xì)胞增殖中的表達(dá)變化及三者在信號通路中的關(guān)系
　　目的：
　　1)觀察不同濃度人抵抗素樣分子-β（resistin-like molecule-β，RELM-β）對體外培養(yǎng)的人肺動脈平滑肌細(xì)胞中黏著斑激酶（focal adhesion kinase， FAK）、生存素（survivin）表達(dá)的影響；
　　2）觀察RELM-β、FAK、survivin三

2、者之間的關(guān)系，探討RELM-β調(diào)控FAK信號通路促進(jìn)HPAMSCs增殖的機制。
　　方法：取材肺癌周圍的正常組織,體外培養(yǎng)至第5-6代。將細(xì)胞隨機分為4組：control組（對照組），重組人RELM-β（recombinant human RELM-β，rhRELM-β）25ng/ml組，50ng/ml組，100ng/ml組。RT-PCR檢測FAK及survivin mRNA表達(dá)水平。WB檢測FAK及survivin的蛋白表達(dá)量，

3、免疫熒光觀察FAK在HPASMCs中的定位表達(dá)，PI單染流試細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期。同時，構(gòu)建FAK和survivin的siRNA，分別轉(zhuǎn)染至體外培養(yǎng)的HPASMCs內(nèi)。RT-PCR分別檢測FAK、survivin mRNA表達(dá)水平。以了解RELM-β對HPASMCs中FAK、survivin表達(dá)的影響，
　　結(jié)果：與對照組比較,不同濃度rhRELM-β刺激 HPASMCs，其FAK、survivin mRNA及蛋白表達(dá)均顯著增高，于

4、50ng/ml組最為顯著（P<0.01)，與對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05)。rhRELM-β明顯升高了HPASMCs S期細(xì)胞比例，同時降低了HPASMCs G0/G1期比例。FAK siRNA能下調(diào)HPASMCs survivin mRNA表達(dá)水平，而survivin siRNA未能下調(diào)HPASMCs中FAK的mRNA表達(dá)水平。
　　結(jié)論：RELM-β促進(jìn)人肺血管平滑肌細(xì)胞增殖的同時,也上調(diào)了HPASMCs中FAK、

5、survivin的表達(dá)。FAK siRNA能抑制survivin在HPASMCs中的表達(dá)，反之不然，說明FAK在細(xì)胞增殖信號傳導(dǎo)通路中位于survivin上游，且兩者均在RELM-β誘導(dǎo)的HPASMCs異常增殖過程中發(fā)揮重要作用。
　　第二部分RELM-β信號通路卷入FAK-survivin信號通路促進(jìn)人肺動脈平滑肌細(xì)胞增殖機制的研究
　　目的:探討FAK-survivin信號通路在RELM-β刺激下人肺動脈平滑肌細(xì)胞增殖中

6、的作用。
　　方法:進(jìn)行人肺動脈平滑肌細(xì)胞的原代培養(yǎng)。根據(jù)本實驗室研究結(jié)果，選擇rhRELM-β濃度(50nmol/ml)進(jìn)行實驗，探討在相同濃度下的延時效應(yīng)。將細(xì)胞分為2組：control組，RELM-β重組蛋白50nmol/ml組。于1、2、4、8h收集細(xì)胞， WB檢測FAK和pFAK、survivin蛋白表達(dá)水平。于48小時流式細(xì)胞術(shù)PI單染法檢測細(xì)胞周期的分布及FITC-AnnexinV/PI雙染色雙變量流式細(xì)胞分析細(xì)胞凋

7、亡率。同時，構(gòu)建FAK的siRNA，轉(zhuǎn)染至體外培養(yǎng)的HPASMCs內(nèi)以降低 HPASMCs中FAK的表達(dá)，并以rhRELM-β刺激培養(yǎng)HPASMCs，實時定量RT-PCR檢測FAK和survivin mRNA表達(dá)水平。Western blotting檢測FAK和pFAK、survivin的蛋白表達(dá)水平。使用BrdU摻入法流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞增殖情況。
　　結(jié)果:在體外培養(yǎng)的人肺動脈平滑肌細(xì)胞中，F(xiàn)AK siRNA有效抑制了RELM-