新型DNA-RNA納米載體的構(gòu)建及其調(diào)控肺動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞生長及機(jī)制的研究.pdf

1、肺動(dòng)脈高壓(Pulmonary arterial hypertension，PAH)是以肺血管壓力增高為其主要特征的一類臨床綜合征，是慢性阻塞性肺疾病、肺心病等臨床肺部疾病的重要病理生理基礎(chǔ)。而低氧肺動(dòng)脈高壓(HPH)是PAH臨床分類的主要類型之一，其主要的病理改變是低氧刺激肺血管平滑肌細(xì)胞和內(nèi)膜組織的異常增生，導(dǎo)致血管腔的狹窄，肺血管阻力增高及肺血管的重構(gòu)。研究表明，肺動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞(Pulmonary artery endotheli

2、al cells，PAECs)的功能紊亂是該病發(fā)生及發(fā)展的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，目前認(rèn)為內(nèi)皮功能紊亂主要包括內(nèi)皮細(xì)胞凋亡抑制，增殖增加，那么為尋求HPH的治療靶點(diǎn)，將內(nèi)皮細(xì)胞在低氧條件下增殖調(diào)控的具體機(jī)制作為研究的重點(diǎn)，探索HPH治療的新方法。
　　自噬(autophagy)是細(xì)胞內(nèi)自體吞噬的一個(gè)過程，在正常的生理狀態(tài)下，它有利于細(xì)胞維持自身穩(wěn)態(tài)，當(dāng)位于應(yīng)激的狀況時(shí)，如低氧、饑餓條件，自噬狀態(tài)的改變將影響細(xì)胞里的穩(wěn)定狀態(tài)，影響細(xì)胞的增殖、凋亡

3、、周期、遷移或侵襲等。自噬是低氧下內(nèi)皮細(xì)胞的一個(gè)重要調(diào)控因素，而ATG101是調(diào)控自噬的重要基因。本文旨在探索低氧對PAECs自噬的影響及其對增殖調(diào)控的具體機(jī)制。
　　針對臨床上的常見病及難治病，傳統(tǒng)的藥物治療，往往是對癥治療，有著藥物副作用大，而且會(huì)再次發(fā)作等問題，為了滿足人們?nèi)找嬖龈叩闹委熜枨?，針對DNA水平上的新型治療方式應(yīng)運(yùn)而生，基因治療(gene therapy)是往機(jī)體或細(xì)胞中導(dǎo)入工作基因來達(dá)到預(yù)想的治療目的。包括:小

4、干擾RNA、非編碼RNA，miRNA等。那么如何將siRNA高效地轉(zhuǎn)運(yùn)，已成為面臨的主要難題之一。而納米系統(tǒng)作為運(yùn)載體已越來越受到人們重視，相對與傳統(tǒng)的病毒類載體，納米系統(tǒng)，尤其是DNA、RNA等天然的生物分子為材料的納米載體，存在免疫原性非常低，易生物降解，低毒或無毒，結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，合成簡單等優(yōu)點(diǎn)，是非病毒運(yùn)載系統(tǒng)中最重要的一種新型運(yùn)載方式。
　　把DNA作為支架，自組裝合成三角板狀的納米載體，并采用DNA-RNA雜交技術(shù)，將運(yùn)載目

5、的基因ATG101siRNA以互補(bǔ)配對的方式組裝入DNA納米三角板，形成新型DNA-RNA納米運(yùn)載系統(tǒng)。研究其在細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)運(yùn)情況，并探索目的基因?qū)Φ脱鯒l件下的PAECs自噬和增殖的影響，及其調(diào)控的分子機(jī)制，提供防治PAH的新理論依據(jù)和治療方法。
　　目的:
　　自組裝能夠攜帶ATG101 siRNA的DNA納米三角板，檢測其胞內(nèi)轉(zhuǎn)染效率，并研究納米系統(tǒng)對PAECs自噬和增殖的影響。
　　方法:
　　1.制備能夠攜

6、帶ATG101siRNA的DNA納米三角板(ATG101siRNA-TNP)并研究其納米系統(tǒng)的特性。
　　(1)采用水浴階梯降溫的方法制備DNA納米三角板攜帶ATG101 siRNA
　　(2)采用原子力顯微鏡、凝膠電泳觀察制備的納米體系的超微結(jié)構(gòu)及合成效率。
　　2.攜帶靶蛋白siRNA的DNA納米三角板在肺癌細(xì)胞內(nèi)攝取及轉(zhuǎn)染效率的檢測。
　　體外培養(yǎng)肺癌細(xì)胞(A549，H292)，DNA納米系統(tǒng)轉(zhuǎn)染A549、

7、H292后，采用激光共聚焦及流式細(xì)胞術(shù)檢測肺癌細(xì)胞對DNA納米系統(tǒng)攝取的時(shí)間和劑量的依賴性;應(yīng)用RT-PCR及Western blot檢測靶蛋白表達(dá)情況。
　　3.攜帶ATG101siRNA的DNA納米三角板對A549細(xì)胞生長的影響
　　ATG101 siRNA-TNP納米系統(tǒng)轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞，電鏡、激光共聚焦、WB檢測細(xì)胞自噬水平的變化，MTT的方法檢測活力，凋亡用流式細(xì)胞術(shù)(FCM)來檢測。
　　4.攜帶靶蛋白AT

8、G101siRNA的DNA納米三角板對PAECs生長的影響
　　體外培養(yǎng)肺動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞(Pulmonary artery endothelial cells，PAECs)，ATG101 siRNA-TNP納米系統(tǒng)轉(zhuǎn)染PAECs后，激光共聚焦觀察自噬熒光表達(dá);Western blot檢測自噬及增殖標(biāo)志蛋白的表達(dá)。
　　5.攜帶靶蛋白ATG101siRNA的DNA納米三角板對低氧條件PAECs生長的影響
　　體外培養(yǎng)PAE

9、Cs，放置于低氧孵育箱中(1％O2、5％CO2、94％N2)中，并用ATG101siRNA-TNP納米系統(tǒng)轉(zhuǎn)染PAECs，分別檢測納米載藥系統(tǒng)對細(xì)胞自噬、增殖及凋亡的影響。
　　6.ATG101是通過Hedgehog信號通路來調(diào)控低氧下PAECs的凋亡
　　ATG101siRNA-TNP納米系統(tǒng)轉(zhuǎn)染PAECs后，采用Western blot檢測ATG101沉默后，信號通路蛋白Hedgehog，Gli的表達(dá)
　　結(jié)果:<

10、br>　　1.成功自組裝構(gòu)建以單鏈DNA作為骨架，siRNA單鏈為載體的DNA納米三角板，原子力顯微鏡觀察示:三角形的納米結(jié)構(gòu)，且分布均勻;凝膠電泳結(jié)果分析:水浴階梯降溫法自組裝合成的納米系統(tǒng)產(chǎn)率高，結(jié)構(gòu)穩(wěn)定。
　　2.腫瘤細(xì)胞系的體系穩(wěn)定，因此以兩種肺癌的細(xì)胞作為預(yù)實(shí)驗(yàn)對象，結(jié)果是兩種肺癌細(xì)胞(H292，A549)均能攝取DNA納米系統(tǒng)，且相對于單獨(dú)的siRNA，納米材料攜帶的siRNA更易被細(xì)胞攝取，并且具有時(shí)間及濃度依賴性，

11、激光共聚焦和流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果均顯示隨著濃度和時(shí)間的增加，其轉(zhuǎn)染效率增強(qiáng);納米系統(tǒng)是巨胞飲及網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的胞吞的路徑進(jìn)入細(xì)胞。納米材料攜帶的siRNA能高效進(jìn)入細(xì)胞并發(fā)揮其生物學(xué)效應(yīng)，RT-PCR和Westerm blot結(jié)果顯示在mRNA及蛋白水平靶蛋白的表達(dá)明顯下降。
　　3.ATG101siRNA-TNP轉(zhuǎn)染入A549細(xì)胞，抑制ATG101的表達(dá)后，抑制細(xì)胞自噬，激活了凋亡，從而導(dǎo)致A549細(xì)胞生長抑制。
　　4.攜帶靶蛋

12、白ATG101 siRNA的DNA納米三角板能被PAECs高效攝入，并沉默
　　靶蛋白ATG101，其效應(yīng)有時(shí)間和濃度依賴性;激光共聚焦及Western blot結(jié)果均顯示抑制靶蛋白后，明顯抑制自噬水平，同時(shí)抑制細(xì)胞生長。
　　5.低氧條件下，PAECs的自噬及增殖水平升高，激光共聚焦及Western blot顯示沉
　　默ATG101后，自噬水平下降，MTT結(jié)果表明細(xì)胞PAECs生長受到抑制，F(xiàn)CM檢測發(fā)現(xiàn)激活了細(xì)胞

13、凋亡。
　　6.低氧條件下，沉默ATG101抑制細(xì)胞自噬后，是通過Hedgehog-GLi信號通路來
　　激活PAECs的凋亡，從而抑制細(xì)胞生長。
　　結(jié)論:
　　1.成功自組裝合成能夠攜帶ATG101siRNA的DNA納米三角板，合成產(chǎn)物產(chǎn)率高，結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，此納米系統(tǒng)可以成功且高效的轉(zhuǎn)入腫瘤細(xì)胞及正常細(xì)胞中，并且發(fā)揮siRNA的生物學(xué)效應(yīng)，說明此納米體系穩(wěn)定，具有廣泛的應(yīng)用前景。
　　2.DNA納米三角板攜