Dhhc2在斑馬魚(yú)神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育過(guò)程中的作用及機(jī)制研究.pdf

1、Dhhc2是dhhc分子家族的一員，該分子家族由一類(lèi)具有特征性Asp-His-His-Cys(dhhc)結(jié)構(gòu)域的蛋白分子組成，廣泛存在于低等如酵母菌，高等如人類(lèi)的各級(jí)生物體內(nèi)。由于dhhc結(jié)構(gòu)域的存在，大多數(shù)dhhc家族蛋白分子有棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶的活性，是目前為止少數(shù)確定的棕櫚?；揎椕浮?br>　　蛋白質(zhì)生物活性的獲得需要經(jīng)歷復(fù)雜的蛋白質(zhì)翻譯后修飾，主要包括磷酸化修飾、糖基化修飾、泛素化修飾、脂質(zhì)化修飾等。其中，脂質(zhì)化修飾包括棕櫚?；揎?/p>

2、，豆蔻?；揎棧愇於┗揎椀?，其中棕櫚?；揎検亲钇毡榈?，而且是唯一可逆的翻譯后脂質(zhì)化修飾，蛋白質(zhì)經(jīng)棕櫚?；揎椇笫杷栽黾樱瑢?duì)脂質(zhì)的親和力增強(qiáng)。因此棕櫚?；揎棇?duì)于蛋白質(zhì)翻譯后的轉(zhuǎn)運(yùn)，膜定位及最終功能活性的獲得由必不可少的意義。
　　棕櫚?；揎椩谀X中的發(fā)生比例遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于身體的其他組織器官，可能與腦內(nèi)脂質(zhì)成分豐富有關(guān)。由于dhhc家族分子普遍具有棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶活性，因此該家族的多種成員被發(fā)現(xiàn)與大腦的功能執(zhí)行及疾病發(fā)生有必不可分的

3、作用，如dhhc17，即hip14。我們?cè)谝园唏R魚(yú)為模型進(jìn)行的研究中發(fā)現(xiàn)，大多數(shù)的dhhc蛋白分子，包括dhhc2在內(nèi)，都在斑馬魚(yú)卵的早期發(fā)育(0～72hpf)過(guò)程中大量表達(dá)于神經(jīng)系統(tǒng)，因此我們推測(cè)該家族分子可能在斑馬魚(yú)的神經(jīng)發(fā)育過(guò)程中起到重要的作用。
　　Dhhc2作為dhhc家族的一員同樣具有棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶活性，已有研究表明在神經(jīng)系統(tǒng)中，dhhc2以psd95，gap43為棕櫚酰化的底物對(duì)神經(jīng)元的突觸活動(dòng)進(jìn)行調(diào)節(jié)，此外該分子還被

4、發(fā)現(xiàn)表達(dá)于多種組織腫瘤中調(diào)節(jié)ckap4等分子的表達(dá)。但該分子在神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育過(guò)程中的具體作用及機(jī)制則沒(méi)有相關(guān)的研究及報(bào)道。
　　本研究在斑馬魚(yú)這一動(dòng)物模型的基礎(chǔ)上，通過(guò)在斑馬魚(yú)胚胎1～4細(xì)胞期注射dhhc2嗎啉反義寡聚核苷酸(mo)特異性的抑制dhhc2的表達(dá)進(jìn)而研究其在斑馬魚(yú)胚胎發(fā)育過(guò)程中起到的作用及相關(guān)的機(jī)制。
　　為了研究dhhc2分子在斑馬魚(yú)胚胎發(fā)育過(guò)程中的作用，我們首先采用胚胎整封原位雜交和RT-PCR的方法，檢測(cè)d

5、hhc2基因在斑馬魚(yú)發(fā)育早期的時(shí)空表達(dá)。結(jié)果顯示，除4細(xì)胞期有明顯母源性表達(dá)外，由1000細(xì)胞期到尾牙期dhhc2在斑馬魚(yú)胚胎中幾乎不表達(dá)，至18hpf開(kāi)始表達(dá)量開(kāi)始明顯升高并維持高水平表達(dá)，且dhhc2在斑馬魚(yú)卵中的主要表達(dá)位置為中后腦區(qū)域。
　　隨后，我們采用在斑馬魚(yú)胚胎早期（1～8細(xì)胞期）顯微注射mo的方法，特異性抑制dhhc2蛋白的表達(dá)，并觀察胚胎發(fā)育。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，dhhc2表達(dá)抑制后的斑馬魚(yú)卵于18hpf及之前的發(fā)育時(shí)期并

6、未表象出明顯表型異常，從24hpf開(kāi)始，mo注射組的斑馬魚(yú)胚胎和對(duì)照組斑馬魚(yú)胚胎相比中后腦區(qū)域出現(xiàn)明顯的畸形。隨后我們檢測(cè)了端腦標(biāo)記基因foxg1、中腦標(biāo)記基因pax2.1、后腦第三第五菱腦節(jié)標(biāo)記基因krox2.0及后腦菱腦節(jié)分界區(qū)標(biāo)記基因rfng。結(jié)果證明，krox2.0在dhhc2 mo注射后表達(dá)明顯減少，而菱腦節(jié)分界區(qū)標(biāo)記基因rfng則有明顯的異位表達(dá)。表明抑制dhhc2表達(dá)后，斑馬魚(yú)胚胎的后腦發(fā)育出現(xiàn)缺陷。
　　為進(jìn)一步明

7、確斑馬魚(yú)后腦發(fā)育異常的原因，我們檢測(cè)斑馬魚(yú)胚胎后腦中神經(jīng)元前體細(xì)胞標(biāo)記物neurod4及膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記物gfap的表達(dá)。結(jié)果顯示，在以mo抑制dhhc2表達(dá)后，原本子斑馬魚(yú)后腦菱腦節(jié)中心部位表達(dá)的gfap表達(dá)范圍縮小，而neurod4表達(dá)范圍增大。由此可見(jiàn)，dhhc2蛋白調(diào)控了斑馬魚(yú)后腦的神經(jīng)元發(fā)生及膠質(zhì)發(fā)生。
　　為了探索dhhc2表達(dá)抑制后斑馬魚(yú)菱腦節(jié)膠質(zhì)細(xì)胞發(fā)生范圍縮小及神經(jīng)元發(fā)生范圍擴(kuò)大的原因。我們檢測(cè)了調(diào)控菱腦節(jié)中心區(qū)域膠

8、質(zhì)細(xì)胞發(fā)生的兩個(gè)主要效應(yīng)基因cyp26b1和sox9b的表達(dá)狀況。RT-PCR和原位雜交結(jié)果表明cyp26b1的表達(dá)量及表達(dá)位置在mo注射前后無(wú)明顯改變，而sox9b的表達(dá)量則在dhhc2表達(dá)抑制后明顯降低。因此，我們推斷，dhhc2表達(dá)抑制引起sox9b的表達(dá)降低進(jìn)而使得后腦的神經(jīng)元發(fā)生和膠質(zhì)細(xì)胞發(fā)生出現(xiàn)異常，引起后腦的畸形。為驗(yàn)證這個(gè)猜想，我們合成了sox9b的mRNA并注射于dhhc2 mo組的斑馬魚(yú)卵中，并于28hpf比較觀察對(duì)

9、照組，dhhc2表達(dá)抑制組，sox9b和mo共注射組的斑馬魚(yú)胚胎后腦表型，結(jié)果證明，sox9b mRNA的注射成功挽救了dhhc2表達(dá)抑制引起的斑馬魚(yú)后腦畸形，同樣，在sox9bmRNA注射后，后腦區(qū)域krox2.0及rfng的表達(dá)趨于正常。以上證據(jù)證明，sox9b的表達(dá)降低是dhhc2 mo注射后產(chǎn)生后腦發(fā)育畸形的主要原因。
　　已有研究證明，cyp26b1和sox9b的表達(dá)受fgfr2下游信號(hào)的調(diào)控，經(jīng)典的fgf受體下游的信號(hào)

10、通路包括fgf-erk，fgf-jrnk，fgf-p38信號(hào)通路;已有實(shí)驗(yàn)證明，fgf-erk信號(hào)調(diào)節(jié)cyp26b1的表達(dá)而對(duì)sox9b的表達(dá)無(wú)影響;鑒于在本實(shí)驗(yàn)中cyp26b1未有明顯變化，我們主要檢測(cè)了另外兩條信號(hào)通路---fgf-jnk及fggp38。我們選取14hpf,20hpf,28hpf斑馬魚(yú)胚胎，采用western blot檢測(cè)了不同處理組β-actin，jnk，p-jnk，p38，p-p38的表達(dá)水平。發(fā)現(xiàn)p-p38水平

11、則在dhhc2 mo注射組明顯降低，p-p38/p38比值下降。以上結(jié)果說(shuō)明dhhc2的表達(dá)抑制干擾了p38的磷酸化水平。
　　以p38磷酸化激活劑anisomycin處理mo注射組魚(yú)卵后，隨著p38磷酸化水平的提高，sox9b表達(dá)下降現(xiàn)象減輕，相應(yīng)的斑馬魚(yú)胚胎的表型也接近正常。
　　通過(guò)以上實(shí)驗(yàn)，我們證實(shí)了dhhc2可能通過(guò)促進(jìn)fgf-p38信號(hào)通路的活化從而調(diào)節(jié)sox9b的表達(dá)，最終影響斑馬魚(yú)后腦發(fā)育過(guò)程中的神經(jīng)元與膠質(zhì)