Sox19b基因?qū)Π唏R魚胚胎早期神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育的調(diào)節(jié)及作用機制的研究.pdf

1、研究目的:
　　 SOX（Sry related high mobility group box）基因家族是一類由SRY相關(guān)基因構(gòu)成的基因家族，最初是由Gubbay.J等在小鼠Y染色體中發(fā)現(xiàn)的起性別決定作用的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，其編碼的蛋白都包含保守型較高的高速泳動蛋白(highmobility group proteins，HMG)結(jié)構(gòu)域。在個體的早期發(fā)育過程中，SOX基因廣泛參與調(diào)控性別決定、軟骨形成、神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育、晶狀體形成及內(nèi)

2、胚層發(fā)育等過程。
　　 Sox19b基因是斑馬魚SOXB1家族中重要成員之一，為母源性表達(dá)，囊胚期之前為泛表達(dá);合子型表達(dá)開始于75％下包時期，主要在預(yù)定神經(jīng)外胚層區(qū)域表達(dá);原腸運動后期，sox19b在神經(jīng)板區(qū)域特異性的表達(dá);24h時期，sox19b的表達(dá)主要集中于中樞神經(jīng)系統(tǒng)及脊索區(qū)域;48h時期，主要表達(dá)在間腦、端腦、中腦和延腦區(qū)域，其表達(dá)模式與小鼠中sox2基因的表達(dá)基本一致。上述研究結(jié)果提示sox19b基因可能在神經(jīng)系統(tǒng)

3、發(fā)育的過程中發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用。
　　 本研究主要是通過抑制sox19b基因的表達(dá)，探索sox19b基因?qū)τ谏窠?jīng)系統(tǒng)發(fā)育過程的調(diào)控作用及機制。目前，對于神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育相關(guān)疾病的發(fā)病機制及治療方法尚不成熟。因此，研究sox19b基因在神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育過程的調(diào)控機制將為臨床治療神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)生相關(guān)的疾病提供新的線索和理論依據(jù)。
　　 研究方法:
　　 本研究主要是利用斑馬魚為模式生物，通過顯微注射嗎啉寡聚核苷酸（Morphol

4、inos，MO）的方法抑制sox19b基因的表達(dá)，通過整封原位雜交、 RT-PCR、組織切片HE染色、BrdU摻入及吖啶橙染色等方法，研究sox19b基因在斑馬魚神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育過程中的調(diào)控作用及機制。
　　 研究結(jié)果:
　　 1、sox19b基因在斑馬魚胚胎早期發(fā)育過程中時空表達(dá)模式的建立
　　 首先，我們通過RT-PCR檢測sox19b基因在斑馬魚胚胎發(fā)育不同時期的表達(dá)量，然后通過胚胎整封原位雜交檢測sox19b

5、基因在斑馬魚胚胎發(fā)育不同時期的表達(dá)情況。結(jié)果顯示，sox19b基因為母源性表達(dá)的基因，囊胚期之前為泛表達(dá);神經(jīng)外胚層形成之后，sox19b主要在神經(jīng)外胚層區(qū)域表達(dá);原腸運動后期，主要表達(dá)在神經(jīng)板區(qū)域;神經(jīng)分化結(jié)束時，sox19b基因主要表達(dá)在中樞神經(jīng)系統(tǒng)以及脊索區(qū)域。
　　 2、sox19b基因?qū)Π唏R魚胚胎早期神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育的調(diào)節(jié)作用
　　 抑制sox19b基因表達(dá)之后，斑馬魚胚胎的神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育過程受到影響。神經(jīng)誘導(dǎo)階段，

6、原位雜交的檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，神經(jīng)外胚層的標(biāo)記基因sox3的表達(dá)區(qū)域明顯減小，神經(jīng)板的標(biāo)記基因otx2和dlx3b基因的表達(dá)也明顯減少。神經(jīng)發(fā)生階段，中前腦的標(biāo)記基因otx2及原神經(jīng)基因neurogl基因的表達(dá)也明顯降低。通過檢測神經(jīng)干細(xì)胞sox2及神經(jīng)前體細(xì)胞ascllb基因的表達(dá)情況，結(jié)果顯示其表達(dá)也明顯減弱。通過BrdU摻入及吖啶橙染色等方法檢測胚胎細(xì)胞增殖及凋亡的情況，實驗結(jié)果顯示，抑制sox19b基因的表達(dá)，會導(dǎo)致中樞神經(jīng)系統(tǒng)區(qū)域細(xì)

7、胞凋亡增加，細(xì)胞增殖減弱。
　　 3、sox19b基因?qū)Π唏R魚胚胎眼睛發(fā)育的調(diào)節(jié)作用
　　 抑制sox19b基因的表達(dá)會導(dǎo)致斑馬魚胚胎眼睛發(fā)育受到抑制，包括小眼或眼睛缺失，視網(wǎng)膜分層及晶狀體的結(jié)構(gòu)異常。視網(wǎng)膜的形成包括視網(wǎng)膜祖細(xì)胞的增殖，細(xì)胞命運決定，神經(jīng)元及膠質(zhì)細(xì)胞形成等過程。通過原位雜交及RT-PCR進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，參與調(diào)控眼區(qū)發(fā)育的眼區(qū)轉(zhuǎn)錄因子(eye field transcriptionfactors，EFTF

8、s)pax2a、vsx2及rx3的表達(dá)區(qū)域及表達(dá)量都明顯減弱或降低。
　　 4、sox19b基因在斑馬魚胚胎早期神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育過程中作用機制的研究
　　 脊椎動物神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育過程依靠外胚層細(xì)胞的胞內(nèi)信號通路之間的相互協(xié)調(diào)來實現(xiàn)的，包括BMP、FGF以及Wnt信號通路等，這些信號通路之間的協(xié)調(diào)作用使得機體神經(jīng)系統(tǒng)和非神經(jīng)系統(tǒng)分化得以實現(xiàn)。抑制sox19b基因的表達(dá)后，通過RT-PCR檢測出BMP及FGF信號通路中部分配體及下