綿羊精原干細胞非分化擴增的影響因素研究.pdf

1、目的：探討精原干細胞體外分離和非分化擴增的影響因素,為研究精原干細胞體內(nèi)外生存條件及長期培養(yǎng)、定向分化和轉(zhuǎn)基因奠定實驗基礎。 方法：本研究中的實驗動物選用2-5月齡綿羊公羔,取其睪丸以2步酶消化法、Percoll不連續(xù)密度梯度離心法、差速貼壁法分離純化綿羊精原干細胞,分別以添加0％、2.5％、5％、10％胎牛血清的DMEM/F12或DMEM為基本培養(yǎng)液,以2×105細胞/cm2的密度接種于睪丸支持細胞或綿羊胎兒成纖維細胞飼養(yǎng)層上

2、,分別置于33℃、35℃、37℃,飽和濕度,5％CO2濃度條件下培養(yǎng),每星期換液2次。每間隔一定時間,置倒置顯微鏡下觀察,或進行堿性磷酸酶(AP)組化染色檢測、鑒定精原細胞。 結(jié)果： 1、Percoll不連續(xù)密度梯度離心和差速貼壁等方法可以有效的分離純化綿羊精原細胞,其中精原細胞主要分布于密度梯度為27％～35％(密度1.0410g/ml～1.0508g/ml)的帶間,純度可達56.7％。 2、37℃條件下培養(yǎng)S

3、SCs不但能有效減少培養(yǎng)體系中的已分化精原細胞,還能促進干細胞的增殖。而在實驗中,35℃條件下的細胞存活時間較長,增殖數(shù)量較多,35℃、37℃都是體外培養(yǎng)綿羊精原干細胞的較理想溫度。 3、在無血清培養(yǎng)液中培養(yǎng)一個星期,只有20％的細胞存活,然而在添加2.5％的FCS中,有大約80％的細胞存活并增殖,當血清濃度超過2.5％時,精原干細胞的比率下降,高濃度的FCS只是提高單個細胞的數(shù)目。 4、在DMEM和DMEM/F12培養(yǎng)

4、基中的細胞活力和增殖能力無明顯差別。 5、兩種飼養(yǎng)層上的精原干細胞早期(1周內(nèi))的生物學行為非常相似,但培養(yǎng)1周后,Sertoli細胞作飼養(yǎng)層的培養(yǎng)體系中保留的精原干細胞要比SFFCs明顯增多,約有30％的SSCs能存活下來并能維持存活到60d左右。Sertoli細胞作為綿羊精原干細胞體外培養(yǎng)的飼養(yǎng)層不但能促進其存活增殖,還是一種簡單快捷的培養(yǎng)方法。 結(jié)論： 1、Percoll不連續(xù)密度梯度離心和差速貼壁等方法可

5、以有效的對綿羊精原細胞進行分離純化,兩種方法結(jié)合分離和純化效果明顯提高。 2.35℃、37℃都可以作為體外培養(yǎng)綿羊精原干細胞的溫度。 3.DMEM和DMEM/F12都適合做綿羊精原干細胞的基礎培養(yǎng)基。在培養(yǎng)液中添加2.5％的胎牛清可促進綿羊精原干細胞的增殖，為綿羊精原干細胞本外培養(yǎng)最適血清濃度。 4、在不添加外源生長因子的情況下,飼養(yǎng)層對綿羊精原干細胞的存活、增殖是必須的,Sertoli細胞作為綿羊精原干細胞體外