大鼠精原干細(xì)胞分離純化方法的探討.pdf

1、隨著社會(huì)經(jīng)濟(jì)發(fā)展,人類生活方式的改變,男性不育的發(fā)病率逐年升高。由于男性不育的發(fā)病機(jī)制和某些環(huán)節(jié)還不甚了解,男性不育的治療面臨著治療手段單一,治療效果欠佳的局面。目前,睪丸生精功能下降所致無(wú)精子癥尚無(wú)確切療效的治療方法。精原干細(xì)胞(spermatogonial stem cells,SSCs)是精子形成的前體細(xì)胞,具有永生化和多能化潛能,在睪丸微循環(huán)中具有增殖分化能力。現(xiàn)有資料證實(shí)SSCs移植于具有免疫豁免的異體睪丸內(nèi)仍可繼續(xù)分化。SS

2、Cs移植技術(shù)可以使睪丸性無(wú)精子癥患者產(chǎn)生精子并獲得生育能力,通過(guò)夫婦間常見(jiàn)的方式自然受孕,符合倫理學(xué)及傳統(tǒng)觀念,更易于患者接受。SSCs移植在治療男性不育過(guò)程中可適用于青春期前和青春期進(jìn)行放化療的腫瘤患者。青春期或青春期前的男孩及青壯年男性的常見(jiàn)惡性腫瘤,例如:何杰金病、睪丸癌、白血病等,隨著現(xiàn)代診斷技術(shù)和外科手術(shù)、放療及化療等診療水平的日益提高,這些患者的長(zhǎng)期生存甚至治愈成為可能。而這類患者在治療的過(guò)程中其睪丸生精功能受到嚴(yán)重?fù)p害。考

3、慮到這一點(diǎn),可在治療前收集患者的SSCs并通過(guò)冷凍等方法保存起來(lái),保存其生育能力。SSCs移植也適用于成年后才發(fā)現(xiàn)的雙側(cè)隱睪,其睪丸未下降到陰囊內(nèi)的患者。這類患者睪丸在高溫的持續(xù)作用下生精功能嚴(yán)重受損,臨床表現(xiàn)為嚴(yán)重的少弱精子癥,甚至無(wú)精子癥。
　　有研究表明,這類患者的睪丸中仍有對(duì)熱不敏感的SSCs和支持細(xì)胞,可利用SSCs培養(yǎng)及移植技術(shù)恢復(fù)睪丸生精功能。SSCs移植同時(shí)適用于嚴(yán)重的睪丸生精功能障礙患者等。近來(lái),研究發(fā)現(xiàn)應(yīng)用自體

4、干細(xì)胞(脂肪源性干細(xì)胞、皮膚源性干細(xì)胞等)可分化誘導(dǎo)為生殖干細(xì)胞后進(jìn)行移植,通過(guò)夫婦間正常的方式受孕。
　　本研究目的:1.探討分離純化精原干細(xì)胞(SSCs)的方法。2.探索簡(jiǎn)便實(shí)用的SSCs細(xì)胞培養(yǎng)方法,降低SSCs的培養(yǎng)成本。該研究作為自體成體干細(xì)胞(脂肪干細(xì)胞、皮膚干細(xì)胞等)移植入睪丸治療少、無(wú)精子癥系統(tǒng)研究的前期探索,將為后續(xù)研究提供寶貴經(jīng)驗(yàn),最終達(dá)到治愈睪丸性不育的目的。
　　材料與方法:1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物選取出生后10

5、天的健康SD雄性大鼠,體重19~25g,隨機(jī)分三組:第一組:①機(jī)械法+兩步酶法制備SSCs懸液;第二組:②機(jī)械法+兩步酶法+percoll分離法制備SSCs懸液;第三組:③機(jī)械法+兩步酶法+percoll分離法+差速貼壁法制備SSCs懸液。2.實(shí)驗(yàn)方法:2.1、取出生后10天的SD大鼠,脫頸處死后無(wú)菌收集雙側(cè)睪丸,分別通過(guò)①機(jī)械法+兩步酶法制備SSCs懸液;②機(jī)械法+兩步酶法+percoll分離法制備SSCs懸液;③機(jī)械法+兩步酶法+p

6、ercoll分離法+差速貼壁法制備SSCs懸液。2.2、c-kit的表達(dá)檢測(cè)將獲得的單細(xì)胞懸液處理后加入兔抗鼠c-kit多克隆抗體,再加入山羊抗兔IgG-FITC熒光二抗,以PBS代替一抗作為對(duì)照,熒光顯微鏡下觀察c-kit的表達(dá)情況。2.3、α6-Integrin的表達(dá)檢測(cè)將純化后的細(xì)胞懸液處理后加入兔抗鼠α6-Integrin多克隆抗體,再滴加即用型生物素化山羊抗兔IgG二抗,漂洗后滴加SABC試劑,再次漂洗。滴加DAB顯色液,以三

7、蒸水終止染色反應(yīng),再分別經(jīng)乙醇脫水,二甲苯透明,中性樹膠封片,顯微鏡下觀察α6-Integrin的表達(dá)情況,用以PBS代替一抗作為對(duì)照。2.4、臺(tái)盼藍(lán)排斥試驗(yàn)檢測(cè)將獲得的單細(xì)胞懸液,用血球記數(shù)板分別計(jì)數(shù)活細(xì)胞和死細(xì)胞,計(jì)算細(xì)胞活性率。2.5、精原細(xì)胞純度的流式細(xì)胞儀檢測(cè)將獲得的單細(xì)胞懸液固定,漂洗,再離心收集細(xì)胞。加入兔抗鼠c-Kit多克隆抗體,4℃過(guò)夜。PBS漂洗后加入山羊抗兔IgG-FITC熒光二抗,4℃避光孵育。PBS漂洗兩次,再

8、以PBS重懸細(xì)胞后進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測(cè)。同時(shí)設(shè)立以PBS代替一抗的陰性對(duì)照,在進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測(cè)時(shí)將相應(yīng)的陰性對(duì)照消減為零,消除自發(fā)熒光背景。2.6、將獲得的單細(xì)胞懸液進(jìn)行培養(yǎng)觀察,免疫組化鑒定,臺(tái)盼藍(lán)排斥試驗(yàn)及流式細(xì)胞儀檢測(cè)后對(duì)結(jié)果進(jìn)行比較分析。
　　結(jié)果：1、①機(jī)械法+兩步酶法制備SSCs懸液;②機(jī)械法+兩步酶法+percoll分離法制備SSCs懸液;③機(jī)械法+兩步酶法+percoll分離法+差速貼壁法制備SSCs懸液生長(zhǎng)情況符

9、合SSCs。2、以c-kit受體作為SSCs的特異性標(biāo)記物,行細(xì)胞免疫組化染色,結(jié)果細(xì)胞膜和核周胞質(zhì)強(qiáng)表達(dá)c-kit。以α6-Integrin受體作為SSCs的特異性標(biāo)記物,行細(xì)胞免疫組化染色,結(jié)果細(xì)胞膜和胞質(zhì)表達(dá)α6-Integrin。兩者與之對(duì)應(yīng)的對(duì)照均呈陰性。3、以臺(tái)盼藍(lán)排斥試驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞活率:①機(jī)械法+兩步酶法細(xì)胞活率(93.26±1.06)％,②機(jī)械法+兩步酶法+percoll分離法3帶細(xì)胞活率(93.50±0.85)％,③機(jī)械

10、法+兩步酶法+percoll分離法+差速貼壁法3帶細(xì)胞活率(94.73±0.82)％;三種方法活率比較:三種方法所得SSCs活率無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。4、①機(jī)械法+兩步酶法制備SSCs懸液精原細(xì)胞陽(yáng)性細(xì)胞百分率為(63.34±0.79)％。②機(jī)械法+兩步酶法+percoll分離法制備SSCs懸液精原細(xì)胞陽(yáng)性細(xì)胞百分率為(74.98±0.26)％。③機(jī)械法+兩步酶法+percoll分離法+差速貼壁法分離純化SSCs精原細(xì)胞陽(yáng)性細(xì)胞

11、百分率為(79.17±0.83)％。三種方法純度比較:三種方法間純度不同(P<0.05)。多重兩兩比較結(jié)果:三種方法兩兩之間純度不同(P<0.05):②法精原細(xì)胞陽(yáng)性細(xì)胞百分率高于①法;③法精原細(xì)胞陽(yáng)性細(xì)胞百分率高于②法;①,②,③法所得SSCs純度呈增高趨勢(shì)(P<0.05)。
　　結(jié)論:1.機(jī)械法,兩步酶法,差速貼壁法,percoll分離法在分離純化過(guò)程中對(duì)SSCs活率影響一致。2.機(jī)械法+兩步酶法能夠分離出較高純度的SSCs,