巴馬小型豬精原干細(xì)胞相關(guān)問題的研究.pdf

1、精原干細(xì)胞(spermatogonial stem cells，SSCs)位于動物睪丸的精細(xì)小管，是動物體內(nèi)唯一一種定向分化為精子的成體干細(xì)胞。分離、純化和體外培養(yǎng)SSC，可以為SSC的體外研究提供必要的實驗材料。定向誘導(dǎo)SSC分化成精子可以研究精子發(fā)生的機(jī)理，同時也可以為無精癥患者提供生育自己后代的機(jī)會。通過轉(zhuǎn)染SSC，誘導(dǎo)其分化成攜帶有外源基因的精子細(xì)胞或精子，利用這些攜帶外源基因的精子細(xì)胞或精子受精就可以產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因動物。這種轉(zhuǎn)基因

2、胚胎產(chǎn)生的過程和自然條件下精子、卵子結(jié)合產(chǎn)生胚胎的過程一樣，不涉及體細(xì)胞重編程過程，所以利用SSC生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因動物的效率要遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于體細(xì)胞核移植法。本論文的研究內(nèi)容是巴馬小型豬SSC的分離、純化、鑒定、體外長期培養(yǎng)以及轉(zhuǎn)基因的研究，其結(jié)果如下:
　　1.巴馬小型豬睪丸的形態(tài)學(xué)觀察和精原干細(xì)胞的鑒定
　　本研究首先對巴馬小型豬睪丸組織進(jìn)行了形態(tài)學(xué)觀察和SSC的鑒定。組織學(xué)觀察結(jié)果發(fā)現(xiàn)1月齡仔豬睪丸的SSC還沒有分化，而2月齡仔豬睪

3、丸中已經(jīng)有精子產(chǎn)生，所以1月齡仔豬睪丸適合于SSC的分離。已有的研究證明豬的精原干細(xì)胞表達(dá)UCHL1，并且可以和植物凝集素DBA結(jié)合，SSC的免疫組織化學(xué)鑒定結(jié)果發(fā)現(xiàn)巴馬小型豬SSC表達(dá)UCHL1和CDH1，可以和植物凝集素DBA結(jié)合，但不表達(dá)C-KIT，從而證明抗體UCHL1、CDH1以及植物凝集素DBA是巴馬小型豬SSC的生物標(biāo)志物，可以用來鑒定體外培養(yǎng)的SSC。所以，本研究選用抗體UCHL1、CDH1和植物凝集素DBA用來鑒定體外

4、培養(yǎng)的精原干細(xì)胞。
　　2.精原干細(xì)胞的分離和體外培養(yǎng)
　　本實驗采用組合酶消化法將巴馬小型豬睪丸組織消化成分散的細(xì)胞，培養(yǎng)60 h，擴(kuò)增SSC的數(shù)量，然后通過差異貼壁法分選出SSC，將分離出的細(xì)胞接種到STO飼養(yǎng)層上進(jìn)行培養(yǎng)。在培養(yǎng)的前兩代，由于細(xì)胞的數(shù)量少，不能形成細(xì)胞簇，從第三代開始，很多細(xì)胞聚集在一起形成細(xì)胞簇，這些細(xì)胞簇的細(xì)胞結(jié)合不夠緊密，邊緣不清晰。目前為止，SSC在體外已經(jīng)傳代達(dá)30代，維持了細(xì)胞簇形成的特性。

5、
　　3.體外培養(yǎng)的精原干細(xì)胞的鑒定
　　免疫熒光染色結(jié)果顯示這些細(xì)胞簇表達(dá)SSC生物標(biāo)志物UCHL1和CDH1，并且可以和植物凝集素DBA結(jié)合，細(xì)胞簇中部分細(xì)胞表達(dá)OCT4; RT-PCR檢測結(jié)果證明這些細(xì)胞簇表達(dá)基因nanog、sox2、vasa、uchll和thyl，鑒定結(jié)果證明這些細(xì)胞簇是由SSC組成。在體外培養(yǎng)的SSC中存在著大小不同的UCHL1陽性細(xì)胞，說明SSC大小本身存在著差異。SSC超微結(jié)構(gòu)觀察發(fā)現(xiàn)體外培養(yǎng)

6、的SSC的線粒體脊比組織內(nèi)SSC線粒體脊豐富。DNA含量分析顯示部分巴馬小型豬SSC在體外長期培養(yǎng)后經(jīng)流式細(xì)胞儀分析發(fā)現(xiàn)單倍體峰。
　　4.精原干細(xì)胞轉(zhuǎn)基因方法的初步探索
　　本研究嘗試將外源基因?qū)氲絊SC中。首先嘗試?yán)弥|(zhì)體轉(zhuǎn)染法將攜帶有綠色熒光蛋白基因的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到SSC中，但結(jié)果發(fā)現(xiàn)這種轉(zhuǎn)染途徑效率低，不能得到陽性細(xì)胞簇。之后，我們嘗試?yán)寐《靖腥痉▽⑼庠椿驅(qū)氲絊SC內(nèi)，實驗發(fā)現(xiàn)在MOI(multiplicit

7、y of infection)值為50時，可以有效的將GFP基因?qū)氲絊SC內(nèi)，可以得到陽性細(xì)胞簇。
　　綜上所述，本研究分離純化了巴馬小型豬SSC，這些SSC可在體外培養(yǎng)到30代以上，為精原干細(xì)胞的基因操作和精子分化機(jī)理的研究提供了充足的實驗材料。本研究還發(fā)現(xiàn)巴馬小型豬SSC在體外長期培養(yǎng)后經(jīng)流式細(xì)胞儀分析發(fā)現(xiàn)了單倍體峰，利用慢病毒感染法可以有效的將GFP基因?qū)氲絊SC內(nèi)。這些研究結(jié)果為轉(zhuǎn)基因巴馬小型豬的生產(chǎn)建立了實驗平臺，也