慢病毒介導(dǎo)狨猴B2m基因沉默的初步研究.pdf

1、免疫缺陷動物是指由于先天性遺傳缺陷或用人工方法造成免疫系統(tǒng)一種或多種成分缺陷的動物，在研究人類許多疾病機理、研發(fā)藥物、器官移植等工作中有重要的作用。構(gòu)建這類疾病相關(guān)的基因修飾動物模型是探究人類各種免疫缺陷疾病分子機理和治療靶點的一種有效手段。近年來許多科研團隊嘗試?yán)眯屡d的基因編輯技術(shù)構(gòu)建各種靈長類動物疾病模型并取得一定進展。慢病毒載體因其具有能介導(dǎo)外源基因在非分裂細(xì)胞中穩(wěn)定高效的表達(dá)、感染率高、免疫反應(yīng)小等優(yōu)點，現(xiàn)已成為構(gòu)建轉(zhuǎn)基因動物

2、和基因治療研究的重要手段。將慢病毒載體特性與RNAi特異性抑制同源基因表達(dá)的作用相結(jié)合，能在多種細(xì)胞中實現(xiàn)針對目標(biāo)基因的沉默，從而特異性降低其表達(dá)，并產(chǎn)生持續(xù)而穩(wěn)定的誘導(dǎo)靶基因沉默的效果。β2-微球蛋白是一個高度保守的低分子量蛋白質(zhì)，是主要組織相容性復(fù)合物MHCⅠ類分子的輕鏈部分，功能是維持MHCⅠ類分子的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定和輔助其向細(xì)胞表面表達(dá)。已有研究證實B2m基因缺陷會導(dǎo)致小鼠體內(nèi)缺乏CD4-CD8+T細(xì)胞，造成免疫缺陷現(xiàn)象;現(xiàn)探究在靈長類

3、動物體內(nèi)下調(diào)B2m基因的表達(dá)后，是否會與嚙齒類動物發(fā)生相似的分子機制。狨猴是小型非人靈長類動物，憑借其體型小、與人類的親緣關(guān)系接近等優(yōu)點，適合建立成為腫瘤動物模型，以便研究腫瘤發(fā)病機理及治療方案的研究。
　　目的：選擇與人類已驗證過的B2m基因shRNA靶點完全同源的狨猴B2m基因序列，在細(xì)胞水平篩選狨猴B2m基因的有效沉默靶點，并進行驗證。利用RNA干擾技術(shù)沉默狨猴B2m基因，分析狨猴B2m基因沉默后其外周血CD4和CD8細(xì)胞數(shù)

4、量上的變化，以期為構(gòu)建免疫缺陷狨猴模型奠定一定基礎(chǔ)。
　　方法：(1)在細(xì)胞水平篩選狨猴B2m基因的有效沉默靶點，然后與狨猴B2m基因進行序列比對，篩選到2條序列完全匹配，將它們合成shRNA干擾序列，并分別插入在介導(dǎo)RNA干擾的慢病毒載體上。將構(gòu)建的兩個慢病毒表達(dá)質(zhì)粒在聚乙烯亞胺(polyethylenimine，PEI)介導(dǎo)下轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，轉(zhuǎn)染后48h，用實時熒光定量法檢測轉(zhuǎn)染細(xì)胞中B2m基因mRNA的水平。(2)分析狨猴

5、CD抗原(CD4+和CD8+)的一般表達(dá)水平:現(xiàn)有的動物資源中共有20只未進行過實驗的狨猴，每只抽取300ml后肢靜脈血用于流式統(tǒng)計狨猴CD4和CD8細(xì)胞的一般水平，為后續(xù)的動物實驗提供實驗依據(jù)。(3)慢病毒介導(dǎo)狨猴B2m基因沉默:選擇干擾效率大于70％的靶點包裝成介導(dǎo)RNAi的慢病毒，將介導(dǎo)B2m基因沉默的慢病毒和空載對照病毒通過狨猴后肢靜脈分別注射到實驗組和對照組動物體內(nèi)，每周取500ml后肢靜脈血進行流式分析和血常規(guī)檢測，分析狨猴

6、CD4和CD8細(xì)胞和CD4/CD8的比值變化。
　　結(jié)果：(1)通過與人源B2m基因shRNA序列進行比對，篩選出2個與狨猴完全同源的B2m沉默靶位點，分別位于狨猴B2m mRNA的405bp～425bp，780bp～800bp。結(jié)果為兩個沉默靶點在轉(zhuǎn)錄水平的沉默效率分別是（46.54±7.91）％(p＜0.05)和（83.22±4.37）％(p＜0.0001)，均有統(tǒng)計學(xué)意義，其中第二個靶點沉默效率大于70％，適合進行后續(xù)的動物

7、水平實驗。(2)將抽取的20份狨猴靜脈血樣進行流式分析，得到的結(jié)果進行統(tǒng)計學(xué)分析，以x±s表示:CD4％的值為(32.9±7.3)％;CD8％的值為(24.9±6.6)％。CD4/CD8的值為(1.47±0.45)。(3)將每周抽取的血樣進行流式分析，結(jié)果顯示與對照組狨猴相比，實驗組狨猴血樣中，CD4、CD8細(xì)胞數(shù)量以及CD4/CD8比值明顯下降，表明慢病毒介導(dǎo)的對狨猴B2m基因進行RNAi后，對狨猴免疫水平有影響。
　　結(jié)論：本