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文檔簡介
1、目的:通過在泌乳素腺瘤細胞中對Galectin-3進行體外基因敲減,為治療泌乳素腺瘤提供實驗基礎,為下一步體內進行垂體泌乳素腺瘤的Galectin-3基因敲除提供重要依據,初步探討Galectin-3在泌乳素腺瘤的發(fā)生、發(fā)展中的作用機制。
方法:
1.泌乳素腺瘤細胞培養(yǎng)及激素水平的測定:選取經單鼻孔蝶竇入路手術切除的泌乳素腺瘤組織,采用懸浮細胞培養(yǎng)法,定時觀察泌乳素腺瘤細胞的生長情況,并進行激素分泌功能測定。
2、 2.重組慢病毒載體介導Galectin-3基因沉默對泌乳素腺瘤細胞的影響的體外研究Galectin-3shRNA慢病毒載體(將其命名為LV-shRNA-Galectin-3)由上海吉凱技術有限公司包裝制備。
將培養(yǎng)的泌乳素腺瘤細胞進行實驗分組,分為轉染組(LV-shRNA-Galectin-3),陰性對照組(為無關序列的發(fā)夾結構病毒載體,由上海吉凱基因提供)和空白對照組(未加任何質粒)。將慢病毒載體轉染目的細胞,分別用Re
3、al-time PCR和Western blot的方法檢測慢病毒載體對Galectin-3的敲除效率,MTT法檢測泌乳素腺瘤細胞的活力,確定LV-shRNA-Galectin-3介導的RNAi對泌乳素腺瘤細胞增殖及凋亡的影響。
3.統(tǒng)計學方法
實驗數據采用SPSS16.0統(tǒng)計軟件進行分析,各組之間的比較采用方差分析,兩兩組間比較采用SNK法。
結果:
1.泌乳素腺瘤細胞的培養(yǎng)及激素水平測定。
4、> 相差倒置顯微鏡下觀察,原代培養(yǎng)的泌乳素腺瘤細胞呈橢圓形或梭形,24h后有部分泌乳素腺瘤開始半貼壁生長,大部分呈懸浮生長。于培養(yǎng)的約第10天開始,成纖維細胞數量開始增多,并逐漸取代泌乳素腺瘤細胞。換下的培養(yǎng)液采用放射免疫方法檢測。測定結果顯示泌乳素腺瘤細胞分泌的激素水平在第7天左右最佳。
2.shRNA在泌乳素腺瘤細胞中對Galectin-3敲減效率。
Real-time PCR結果顯示LV-shRNA-Gale
5、ctin-3轉染泌乳素腺瘤細胞后,其 Galectin-3的mRNA的表達比未敲減組降低了70%以上,p<0.05,陰性對照組和空白組表達水平沒有明顯下降。
Western Blot檢測結果顯示,shRNA明顯降低泌乳素腺瘤細胞中Galectin-3的蛋白表達,抑制效率達到70%以上,p<0.05,而陰性對照組與空白組相比較,差異無統(tǒng)計學意義,p>0.05。
3. MTT法檢測泌乳素腺瘤細胞的增殖能力。
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