慢病毒介導BC047440基因沉默逆轉(zhuǎn)HepG2-ADM細胞化療耐藥性機制的初步研究.pdf

1、目的和意義：
　　 原發(fā)性肝癌是世界上最常見的消化道腫瘤之一，其發(fā)病率和病死率在惡性腫瘤中均位居前列[1]。原發(fā)性肝癌對我國人群健康危害非常巨大，目前以手術(shù)切除為主的綜合治療的總體療效不佳，其5年生存率僅有5%左右。輔助化療療效不佳是主要治療困難之一，其主要是由于原發(fā)性肝癌的多藥耐藥(multiple drug resistance，MDR)所致[2]。研究表明，肝癌的發(fā)生、發(fā)展是涉及多基因、多因素、多步驟的一個過程，癌基因、細

2、胞周期調(diào)節(jié)基因、細胞凋亡基因等眾多基因的異常激活或異常失活是肝癌發(fā)生的分子基礎(chǔ)[3]，而其包括化療耐藥在內(nèi)的多種臨床生物學行為則是多種拮抗/促進因子平衡紊亂的結(jié)果[4]。通過基因?qū)W操作在分子水平上干預(yù)發(fā)生紊亂的平衡可能是解決肝癌多藥耐藥的關(guān)鍵。
　　 在前期的研究中，我們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)一條功能未知的基因BC047440[5]，其在肝癌組織中呈高表達，且與肝癌的惡性程度呈正相關(guān)[6]，本實驗利用RNAi技術(shù)，采用慢病毒介導HepG2/A

3、DM細胞系BC047440基因沉默，建立BC047440 RNA干擾模型，觀察沉默BC047440基因后對HepG2/ADM細胞生物學特性的影響，并進一步檢測BC047440沉默后相關(guān)基因在蛋白及mRNA水平的變化，初步探討慢病毒介導shRNA沉默BC047440基因逆轉(zhuǎn)HepG2/ADM化療耐藥性的作用機制，為進一步的肝癌基因治療打下基礎(chǔ)。
　　 方法：
　　 1.以適當?shù)味鹊穆《绢w粒BC047440-shRNA及C

4、ontrol-shRNA感染HepG2/ADM細胞，培養(yǎng)48、72 h后在普通光鏡及對應(yīng)熒光顯微鏡下觀察細胞中綠色熒光表達，選擇細胞狀態(tài)較好、綠色熒光表達率較高、強度較強的MOI值作為最適MOI值，并以此建立BC047440 RNA干擾模型。
　　 2.實驗分為BC047440-shRNA組、control-shRNA組及HepG2/ADM組，其中BC047440-shRNA組、control-shRNA組分別加入對應(yīng)重組慢病毒

5、及對照空白慢病毒，HepG2/ADM組只加培養(yǎng)基，培養(yǎng)96h后提取各組HepG2/ADM細胞總蛋白行WesternBlotting檢測BC047440蛋白變化。
　　 3.實驗分組同方法2，以阿霉素終末濃度2.5ug/ml培養(yǎng)各組細胞。分別于培養(yǎng)后24h、48h、72h采用CCK-8于酶聯(lián)免疫檢測儀測定波長460nm的吸光度值[D(460)]，計算其生長抑制率。
　　 4.實驗分組同方法2，取各組對數(shù)生長期細胞，培養(yǎng)48

6、h后，用流式細胞儀檢測、分析細胞周期分布的變化。各組細胞以終末濃度為0.04ug/ml的阿霉素作用48h后，于流式細胞儀檢測細胞凋亡率。
　　 5.實驗分組同方法2，培養(yǎng)96h后提取各組細胞總蛋白及總RNA，Western Blotting檢測各組NF-κB蛋白表達變化，Real time PCR檢測各組細胞Survivin、CCNL1基因mRNA表達變化。
　　 結(jié)果：
　　 1.成功建立BC047440 RN

7、A干擾模型；Western Blotting檢測提示培養(yǎng)96h后BC047440-shRNA組BC047440蛋白的相對表達量(0.353±0.009)較control-shRNA組(1.159±0.042)及HepG2/ADM組(1.205±0.019)降低，其差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，control-shRNA組與HepG2/ADM組BC047440蛋白相對表達量的差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；BC047440-shR

8、NA組BC047440蛋白抑制率為71.5%。
　　 2.培養(yǎng)24h、48h后阿霉素對BC047440-shRNA組細胞生長抑制作用(生長抑制率24h為0.593±0.317、48h為0.846±0.017)較control-shRNA組(生長抑制率24h為0.355±0.027、48h為0.527±0.029)及HepG2/ADM組(生長抑制率24h為0.341±0.027、48h為0.518±0.025)增強，其差異具有統(tǒng)計

9、學意義(P<0.05)；培養(yǎng)72h后阿霉素對各組細胞生長抑制作用差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。
　　 3.流式細胞技術(shù)結(jié)果顯示BC047440-shRNA組細胞凋亡高于control-shRNA組及HepG2/ADM組，細胞周期多阻滯于S期，而control-shRNA組與HepG2/ADM組細胞周期則主要阻滯于G0/G1期。
　　 4.Western Blotting檢測NF-κB蛋白的相對表達量，以β-actin

10、為參照，提示培養(yǎng)96h后BC047440-shRNA組NF-κB蛋白的相對表達量(0.196±0.006)低于control-shRNA組(0.526±0.009)及HepG2/ADM組(0.552±0.023)表達降低，其差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，control-shRNA組與HepG2/ADM組NF-κB蛋白相對表達量的差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；BC047440-shRNA組NF-κB蛋白抑制率為67.39%。

11、r>　　 5.Real time PCR檢測Survivin基因mRNA的相對表達量，以β-actin為參照，BC047440-shRNA組Survivin基因mRNA的相對表達量(2-△ct=0.018±0.001)較control-shRNA組(2-△ct=0.0415±0.0015)及HepG2/ADM組(2-△ct-0.048±0.002)降低，其差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，control-shRNA組與HepG2/A

12、DM組Survivin基因mRNA相對表達量的差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，BC047440-shRNA組Survivin基因mRNA相對表達量約為control-shRNA組的37%，約為HepG2/ADM組的42%；檢測CCNL1基因mRNA的相對表達量，以β-actin為參照，BC047440-shRNA組CCNL1基因mRNA的相對表達量(2-△ct=0.0995±0.0035)較control-shRNA組(2-△ct=0

13、.0285±0.0015)及HepG2/ADM組(2-△ct=0.0415±0.0015)升高，其差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，control-shRNA組和HepG2/ADM組CCNL1基因mRNA相對表達量的差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，BC047440-shRNA組CCNL1基因mRNA的相對表達量約為control-shRNA組3.5倍，約為HepG2/ADM組2.4倍。
　　 結(jié)論：
　　 1.成功建