基于狗尾草花葉病毒構(gòu)建病毒介導(dǎo)的基因沉默載體.pdf

1、病毒誘導(dǎo)的基因沉默（virus-induced gene silencing，VIGS）是最近幾年來較為盛行的一種運(yùn)用植物病毒載體來抑制植物宿主內(nèi)源基因表達(dá)的有效手段。病毒通過改造后攜帶了一段和植物同源的基因，進(jìn)而通過侵染誘導(dǎo)植物沉默內(nèi)源基因。宿主VI GS作為一項(xiàng)有效的研究植物基因功能的實(shí)驗(yàn)方法，具有操作簡單、周期短、效率高、成本低廉等特點(diǎn)。狗尾草花葉病毒（Foxtail mosaic virus,FoMV）是馬鈴薯X病毒屬（Pote

2、xvirus）的成員，單鏈正義RNA，有著非常廣泛的宿主范圍，可侵染包括水稻、大麥、高粱等56種禾本科植物和35種雙子葉植物。國內(nèi)外對(duì)于利用FoMV改造成病毒VIGS載體還沒有相關(guān)的報(bào)道。
　　本研究以pCB301-FoMV載體為母體，設(shè)計(jì)了2種病毒載體構(gòu)建策略：1、通過破壞5A的ORF框，使其不表達(dá)，同時(shí)在其中插入多克隆位點(diǎn)，構(gòu)建載體pCB301-FoMV-Vector-MCS，2、在野生型FoMV的CP終止密碼子之后插入多克隆

3、位點(diǎn)，構(gòu)建載體pCB301-FoMV-CP-MCS。在以上兩個(gè)病毒載體的基礎(chǔ)上，以重復(fù)外殼蛋白亞基因組啟動(dòng)子的方式，利用該病毒載體表達(dá)綠色熒光蛋白（GFP）。本實(shí)驗(yàn)選取了與FoMV同屬的馬鈴薯X病毒（PVX）的CP亞基因組啟動(dòng)子，完成對(duì)pC B301-FoMV-Vector-PVX-GFP和pCB301-FoMV-CP-PVX-GFP的構(gòu)建，結(jié)果表明，pCB301-FoMV-Vector-PVX-GFP浸潤接種的本氏煙在接種葉和系統(tǒng)葉都

4、無綠色熒光，并且在系統(tǒng)葉葉也檢測不到病毒，pCB301-FoMV-Vector-PVX-GFP沒有侵染活性，其原因可能是，雖5A蛋白對(duì)于病毒的復(fù)制不重要，但5A蛋白的堿基序列對(duì)于指引CP的正確表達(dá)起作用。載體pCB301-FoMV-CP-PVX-GFP，在接種葉能發(fā)出綠色熒光，但是熒光僅限制在接種區(qū)域，系統(tǒng)葉并沒有出現(xiàn)綠色熒光，經(jīng)RT-PCR分析，在系統(tǒng)葉卻能檢測到病毒，但所擴(kuò)增出的條帶和預(yù)期大小不符，出現(xiàn)了和野生型病毒相同的條帶。

5、r>　　在載體pCB301-FoMV-CP-MCS的基礎(chǔ)上，我們反向插入了本氏煙的Su片段和大麥的PDS片段，獲得pCB301-FoMV-CP-NbSu和pCB301-FoMV-CP-HvPDS克隆。pCB301-FoMV-CP-NbSu接種結(jié)果表明，在本氏煙中成功誘導(dǎo)了本氏煙對(duì)自身Su基因的沉默，出現(xiàn)了黃斑現(xiàn)象。在單子葉植物大麥（Hordeum v ulgare）中，我們先將攜帶有大麥PDS片段的病毒載體pCB301-FoMV-CP-