慢病毒介導(dǎo)ERCC1基因沉默對卵巢上皮癌鉑類藥物耐藥的機制研究.pdf

1、本課題的研究目的是通過分析ERCC1表達與EOC患者臨床病理參數(shù)、鉑化療和臨床預(yù)后的關(guān)系，評估ERCC1在EOC患者鉑類化療及預(yù)后中的價值。在卵巢上皮癌順鉑耐藥細(xì)胞株SKOV3/DDP及其親本細(xì)胞株SKOV3中檢測ERCC1 mRNA和蛋白的表達水平，在細(xì)胞水平驗證DDP對ERCC1表達的影響。采用RNA干擾(RNA interference，RNAi)技術(shù)，構(gòu)建ERCC1穩(wěn)定沉默細(xì)胞株，通過慢病毒載體介導(dǎo)在細(xì)胞水平觀察ERCC1基因沉

2、默前后卵巢上皮癌細(xì)胞對順鉑的耐藥性、細(xì)胞增殖及凋亡等的影響，探討ERCC1在EOC鉑類化療耐藥中的分子機制，評價ERCC1能否作為EOC鉑類化療敏感性指標(biāo)及預(yù)后預(yù)測指標(biāo)，為EOC鉑類化療耐藥提供臨床及實驗依據(jù)，為EOC耐藥提供新的治療靶點。
　　第一部分ERCC1在卵巢上皮癌患者組織中的表達，與臨床病理參數(shù)、鉑類化療耐藥及預(yù)后的相關(guān)性分析
　　目的:
　　通過檢測ERCC1蛋白在EOC患者組織中的表達，探討ERCC1蛋

3、白表達與EOC患者臨床病理特征、鉑類化療中的意義及與臨床預(yù)后的關(guān)系。
　　材料與方法:
　　1、一般資料:選擇2008年1月至2013年12月在廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院住院治療的92例EOC患者的存檔蠟塊作為研究對象。
　　2、方法:采用免疫組化SP法檢測92例EOC患者組織中ERCC1蛋白的表達，分析ERCC1蛋白表達與臨床病理特征、鉑類化療和預(yù)后的關(guān)系。
　　3、隨訪情況:隨訪截止日期為2014年6月，隨訪時

4、間為5～62個月，中位隨訪時間28個月。
　　4、統(tǒng)計學(xué)方法:ERCC1蛋白表達在EOC患者臨床病理特征分組間及EOC患者鉑類化療耐藥性的比較采用personx2檢驗分析。
　　結(jié)果:
　　1、92例EOC患者ERCC1蛋白的陽性表達率為89.13％(82/92);患者的年齡、病理類型、細(xì)胞分化及臨床分期在ERCC1蛋白表達組間差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05);鉑耐藥者ERCC1蛋白高表達率高于敏感者，差異有統(tǒng)計學(xué)意

5、義(X2=6.787，P=0.009)。
　　2、92例EOC患者中位PFS48.0，ERCC1高表達中位PFS18.0，低表達中位PFS缺失。兩種表達的生存時間無統(tǒng)計學(xué)差異。(X2=1.148，P=0.248)。中位OS30.0，ERCC1高表達中位OS25.0，低表達中位OS48.0。兩種表達的生存時間無統(tǒng)計學(xué)差異。(X2=2.001，P=0.157)。
　　3、COX多因素回歸分析發(fā)現(xiàn)病理分化程度、臨床分期是影響本組預(yù)

6、后的危險因素(P=0.005; P=0.000);ERCC1蛋白表達不是影響EOC患者預(yù)后的危險因素(P=0.056)。
　　結(jié)論:
　　1、ERCC1蛋白在EOC患者組織中存在較高的表達;化療耐藥者ERCC1蛋白陽性表達率高于化療敏感者，提示ERCC1蛋白的表達與臨床含鉑化療方案的敏感性有關(guān)，ERCC1蛋白表達可作為EOC患者鉑類化療敏感的預(yù)測指標(biāo)。
　　2、病理分化和臨床分期是影響EOC患者預(yù)后的危險因素。ERCC

7、1蛋白低表達者PFS及OS與ERCC1蛋白高表達者比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義。ERCC1蛋白表達作為EOC患者預(yù)后預(yù)測指標(biāo)尚需大樣本及分層研究。
　　第二部分ERCC1在人卵巢上皮性癌順鉑敏感株/耐藥株SKOV3中的表達
　　目的:
　　1、檢測SKOV3/DDP及SKOV3細(xì)胞在不同順鉑濃度下細(xì)胞增殖、細(xì)胞凋亡的變化。
　　2、采用實時熒光定量PCR和免疫印記法分別檢測ERCC1 mRNA和蛋白在SKOV3/DDP

8、及SKOV3細(xì)胞中的表達差異。
　　方法:
　　1、采用CCK-8法檢測在不同順鉑濃度作用下SKOV3/DDP及SKOV3細(xì)胞的活性;AnnexinⅤ-FITC/PI凋亡雙染色法檢測順鉑處理前后細(xì)胞的凋亡。
　　2、采用實時熒光定量PCR，2-△CT法進行相對定量分析，以GAPDH為內(nèi)參基因?qū)ι蠘恿窟M行校正，檢測ERCC1 mRNA在SKOV3/DDP及SKOV3細(xì)胞中的表達差異。免疫印記法檢測ERCC1蛋白在SKOV

9、3/DDP及SKOV3細(xì)胞中的表達差異。
　　3、采用SPSS20.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析。
　　結(jié)果:
　　1、細(xì)胞活性檢測結(jié)果顯示不同劑量DDP處理SKOV3及SKOV3/DDP細(xì)胞株24小時后，SKOV3的細(xì)胞活性低于SKOV3/DDP，兩組細(xì)胞間活性百分比值差異有顯著性意義。
　　2、對DDP處理前后SKOV3及SKOV3/DDP細(xì)胞株的凋亡情況進行了檢測，結(jié)果顯示SKOV3/DDP細(xì)胞的凋亡率低于SKOV

10、3細(xì)胞，兩組細(xì)胞間細(xì)胞凋亡率差異有顯著性意義(F=69.272，P＜0.001)。
　　3、RT-PCR檢測結(jié)果顯示:SKOV3/DDP與SKOV3相比，ERCC1 mRNA含量增高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。t=-9.856，p=0.001，N=3。
　　4、Western印跡法檢測結(jié)果顯示: SKOV3/DDP細(xì)胞中ERCC1蛋白的相對表達量高于SKOV3，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。t=-33.219，p＜0.001，N=3。
　

11、　結(jié)論:
　　1、SKOV3/DDP細(xì)胞株較SKOV3細(xì)胞，對DDP具有明顯的耐藥性，可進行后續(xù)相關(guān)的細(xì)胞耐藥實驗。
　　2、 ERCC1 mRNA和蛋白因在SKOV3/DDP細(xì)胞中的表達明顯升高，提示ERCC1基因可能是導(dǎo)致順鉑耐藥的因子之一。
　　第三部分ERCC1基因缺陷型細(xì)胞株的構(gòu)建
　　目的:
　　構(gòu)建ERCC1穩(wěn)定沉默細(xì)胞株并鑒定其干擾效能。
　　方法:
　　1、人工合成3條特異性干

12、擾ERCC1的shRNA片段，定向克隆插入SupersilencingshRNA質(zhì)粒表達載體pLVX-shRNA獲得3種ERCC1 shRNA表達載體。
　　2、慢病毒轉(zhuǎn)染法將上述3條質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至SKOV3/DDP細(xì)胞，RT-PCR檢測ERCC1mRNA的沉默水平，挑選具有最佳沉默效果的質(zhì)粒，選擇最佳穩(wěn)定沉默ERCC1的細(xì)胞株，RT-PCR和免疫印記法檢測穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系中ERCC1 mRNA和蛋白的表達。
　　3、采用SPSS

13、20.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析。
　　結(jié)果:
　　1、3種ERCC1 shRNA表達載體構(gòu)建成功，RT-PCR結(jié)果表明pLVX-ERCC1 shRNA1對ERCC1干擾效果較好，綜合考慮shRNA1為基因最佳片段。F=40.354，p＜0.001，N=3。
　　2、將shRNA1重組質(zhì)粒穩(wěn)定轉(zhuǎn)染至SKOV3/DDP細(xì)胞，ERCC1蛋白水平的表達量明顯下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。t=4.536，P=0.011,N=3。
　

14、　3、成功篩選出穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞株進行后續(xù)實驗，并命名為pLVX-ERCC1 shRNA1。
　　結(jié)論:
　　ERCC1 shRNA表達載體構(gòu)建成功，獲得ERCC1基因穩(wěn)定沉默的SKOV3/DDP細(xì)胞系。
　　第四部分慢病毒介導(dǎo)ERCC1基因沉默逆轉(zhuǎn)卵巢上皮癌細(xì)胞株順鉑耐藥的實驗研究
　　目的:
　　研究ERCC1基因沉默對卵巢癌順鉑耐藥細(xì)胞株SKOV3/DDP耐藥性的影響及其可能機制。
　　方法:

15、r>　　1、pLVX-shRNA慢病毒轉(zhuǎn)染人卵巢上皮癌鉑類耐藥細(xì)胞株SKOV3/DDP，獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系，對照組細(xì)胞為SKOV3/DDP-shRNAC，實驗組細(xì)胞為SKOV3/DDP-shRNA1。CCK-8法檢測不同劑量DDP對對照組細(xì)胞和轉(zhuǎn)染后細(xì)胞（實驗組細(xì)胞）細(xì)胞活性的影響。
　　2、AnnexinⅤ-FITC/PI凋亡雙染色法檢測DDP作用前后對對照組細(xì)胞和轉(zhuǎn)染后細(xì)胞（實驗組）細(xì)胞凋亡的影響。
　　3、流式細(xì)胞儀(

16、FCM)檢測DDP作用前后對對照組細(xì)胞和轉(zhuǎn)染后細(xì)胞（實驗組）細(xì)胞周期的影響。
　　4、采用SPSS20.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，計量資料結(jié)果以x±s表示，兩組數(shù)據(jù)使用兩獨立樣本t檢驗或兩因素析因設(shè)計的方差分析，并比較交互效性，主效應(yīng)、單獨效應(yīng)及多重比較。多組數(shù)據(jù)采用單因素方差分析(One-Way ANOVA)，并進行方差齊性檢驗，方差不齊時采用welch檢驗。多重比較采用LSD法或Dunnett's法。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意

17、義。采用GraphPad Prism5統(tǒng)計繪圖和SPSS20.0畫圖。
　　結(jié)果:
　　1、析因方差分析不同DDP劑量下對照組和實驗組細(xì)胞間細(xì)胞活性百分比值的結(jié)果。
　　2、細(xì)胞凋亡檢測結(jié)果提示兩組細(xì)胞間細(xì)胞凋亡率差異有顯著性意義(F=25.950，P＜0.001)。
　　3、細(xì)胞周期分析結(jié)果顯示在G1期對照組和實驗組細(xì)胞，組間比較細(xì)胞凋亡率差異有顯著性意義(F=161.940，P＜0.001)，有/無DDP作用