應(yīng)用慢病毒介導(dǎo)生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因雞的初步研究.pdf

1、轉(zhuǎn)基因雞在畜牧行業(yè)不僅是一種重要的經(jīng)濟(jì)動(dòng)物，而且雞的輸卵管生物反應(yīng)器是生產(chǎn)藥物蛋白的理想生物反應(yīng)器，轉(zhuǎn)基因雞的生產(chǎn)具有廣闊的應(yīng)用前景。本研究構(gòu)建了不同的慢病毒載體，并對(duì)慢病毒轉(zhuǎn)基因雞研究的方法進(jìn)行了系統(tǒng)的探索，取得如下結(jié)果:慢病毒轉(zhuǎn)基因載體的構(gòu)建:在本研究中構(gòu)建了過(guò)表達(dá)的GV358-LV-HLF、pLVX-IRES-LTF-EGFP和pCDH-CMV-LTF-mcherry載體慢病毒載體，三個(gè)載體以CMV啟動(dòng)子調(diào)控表達(dá)HLF和LTF的基

2、因序列，通過(guò)本實(shí)驗(yàn)室的三質(zhì)粒包裝慢病毒系統(tǒng)分別包裝出了高滴度的慢病毒，通過(guò)倍比稀釋的方法檢測(cè)出慢病毒滴度達(dá)到109TU/mL。不同因素對(duì)慢病毒轉(zhuǎn)基因制備效率的探索:本研究探索了不同因素對(duì)種蛋孵化率的影響。通過(guò)不同封口方式試驗(yàn)結(jié)果顯示:種蛋石蠟封口，出殼率70％。種蛋封口膜封口，出殼率60％。均低于對(duì)照組出殼率100％。不同開口位置對(duì)雞胚孵化率的影響。種蛋鈍端開口，孵化率為70％。種蛋赤道面開口，孵化率為50％，均低于對(duì)照組孵化率為100

3、％。不同口徑的注射器械對(duì)雞胚孵化率的影響。1mL注射器注射種蛋，孵化率為60％。20μL微量注射器注射種蛋，孵化率為60％。40um口徑的顯微注射針注射種蛋，孵化率為70％。均低于對(duì)照組孵化率100％。赤道面開口注射不同溶液對(duì)雞胚發(fā)育的損傷。臺(tái)盼藍(lán)注射種蛋，孵化率為0％。PBS注射種蛋，孵化率為25％。生理鹽水注射種蛋，孵化率為30％。均低于對(duì)照組孵化率100％。慢病毒制備轉(zhuǎn)基因雞:鈍端注射不同滴度慢病毒對(duì)雞胚發(fā)育的影響。慢病毒滴度10

4、8TU/mL注射種蛋，孵化率50％。慢病毒滴度107TU/mL注射種蛋，孵化率50％。慢病毒滴度106TU/mL注射種蛋，孵化率65％。慢病毒滴度105TU/mL注射種蛋，孵化率65％。生理鹽水組孵化率70％。赤道面用109TU/mL慢病毒液注射種蛋，出殼數(shù)10只，孵化率50％。慢病毒轉(zhuǎn)基因雞胚胎和雞的檢測(cè):提取血液和組織DNA，PCR檢測(cè)。鈍端注射制備轉(zhuǎn)基因雞的方法未檢測(cè)到陽(yáng)性的轉(zhuǎn)基因雞。赤道面注射制備轉(zhuǎn)基因雞的方法在雞喙、胰腺、腦、