表達非分泌白介素12的新型溶腫瘤腺病毒對敘利亞倉鼠胰腺癌的治療作用.pdf

1、本研究構(gòu)建了三個基因刪除(TD)并表達非分泌IL-12(nsIL-12)的新型溶腫瘤腺病毒Ad-TD-nsIL-12。在具有完整免疫系統(tǒng)的敘利亞倉鼠體內(nèi)進行了Ad-TD-nsIL-12的抗腫瘤效果和安全性研究。
　　第一部分 新型溶腫瘤腺病毒的構(gòu)建與鑒定
　　1 目的:構(gòu)建并鑒定具有腫瘤靶向性和表達免疫治療基因的新型溶腫瘤腺病毒。
　　2 方法:2.1 高保真酶克隆目的基因，插入含有左右同源臂的穿梭質(zhì)粒載體中，構(gòu)建重組

2、穿梭載體。2.2 將構(gòu)建好的重組穿梭質(zhì)粒線性化，通過電擊轉(zhuǎn)化與腺病毒載體在BJ5183細菌中進行同源重組。2.3 將構(gòu)建成功的腺病毒載體線性化，轉(zhuǎn)染293細胞，生成有感染能力的病毒。批量生產(chǎn)并純化病毒。純化后的病毒進行全基因組測序，ELISA檢測細胞感染病毒后IL-12的表達水平。2.4 分離人、敘利亞倉鼠和小鼠的外周血單個核細胞(PBMC)，在PHA刺激后，加入IL-12標(biāo)準(zhǔn)品和新型溶腫瘤病毒表達的IL-12，檢測單個核細胞增殖情況。

3、分離敘利亞倉鼠的脾細胞，在PHA刺激后，加入人IL-12，檢測敘利亞倉鼠脾細胞表達IFN-γ和TNF-α的表達。
　　3 結(jié)果:3.1 測序分析證實成功構(gòu)建了pssIL-12、pssnsIL-12和pssLUC重組穿梭載體。3.2 酶切鑒定和測序分析證實，成功構(gòu)建了新型溶腫瘤腺病毒載體Ad-TD-IL-12、Ad-TD-nsIL-12和Ad-TD-LUC.3.3 成功生產(chǎn)出高滴度的腺病毒，基因組測序表明病毒基因序列完全正確，ELI

4、SA結(jié)果顯示Ad-TD-IL-12和Ad-TD-nsIL-12均表達IL-12。3.4 Ad-TD-IL-12和Ad-TD-nsIL-12表達的人IL-12刺激人和敘利亞倉鼠的PBMC的增殖，而不能刺激小鼠的PBMC的增殖。人IL-12能刺激敘利亞倉鼠脾細胞表達IFN-γ，和TNF-α。
　　4 結(jié)論:成功構(gòu)建和生產(chǎn)了表達治療基因的新型靶向溶腫瘤腺病毒，并發(fā)現(xiàn)人IL-12對敘利亞倉鼠免疫細胞有功能。
　　第二部分 新型溶腫瘤

5、腺病毒對敘利亞倉鼠胰腺癌的治療作用
　　1 目的:檢測新型溶腫瘤腺病毒對胰腺癌的治療作用。
　　2 方法:2.1 細胞殺傷實驗（MTS法）檢測dl1520和新型溶腫瘤腺病毒對敘利亞倉鼠胰腺癌和腎癌細胞系的殺傷作用。2.2 通過復(fù)制實驗檢測dl1520和新型溶腫瘤腺病毒在正常細胞和腫瘤細胞中的復(fù)制能力。2.3 構(gòu)建敘利亞倉鼠胰腺癌HPD1NR皮下腫瘤模型，當(dāng)腫瘤體積為80mm3和160mm3時，檢測dl520和Ad-TD-LU

6、C的治療作用;當(dāng)腫瘤體積達到310mm3時，檢測Ad-TD-LUC，Ad-TD-IL-12和Ad-TD-nsIL-12的治療作用。2.4 構(gòu)建敘利亞倉鼠胰腺癌Hap-T1原位腫瘤模型，檢測不同劑量下Ad-TD-LUC，Ad-TD-IL-12和Ad-TD-nsIL-12的治療作用。2.5 構(gòu)建敘利亞倉鼠胰腺癌腹腔播散腫瘤模型，檢測不同劑量下Ad-TD-LUC，Ad-TD-IL-12和Ad-TD-nsIL-12的治療作用。
　　3 結(jié)

7、果:3.1 細胞殺傷實驗發(fā)現(xiàn)新型溶腫瘤腺病毒對敘利亞倉鼠胰腺癌和腎癌細胞系的殺傷作用比dl1520更強。3.2 病毒復(fù)制實驗表明新型溶腫瘤腺病毒比dl1520在正常細胞中復(fù)制能力弱，在腫瘤細胞中比dl1520強。3.3 在敘利亞倉鼠倉鼠胰腺癌HPD1NR皮下腫瘤模型中，當(dāng)腫瘤體積為80mm3和160mm3時，dl520和Ad-TD-LUC都對腫瘤具有較好的治療作用;當(dāng)腫瘤體積為160mm3時，dl520無明顯療效，但Ad-TD-LUC能

8、顯著抑制腫瘤生長;當(dāng)腫瘤體積達到310mm3時，Ad-TD-IL-12和Ad-TD-nsIL-12能完全治愈腫瘤，而Ad-TD-LUC無明顯腫瘤抑制作用。3.4 在低劑量下，Ad-TD-nsIL-12能顯著提高荷胰腺癌Hap-T1原位腫瘤的敘利亞倉鼠生存率，Ad-TD-LUC無明顯治療效果，而Ad-TD-IL-12導(dǎo)致全部實驗動物比對照組死亡更早。在提高Ad-TD-LUC和Ad-TD-nsIL-12的劑量和降低Ad-TD-IL-12的劑

9、量后，Ad-TD-nsIL-12能顯著提高敘利亞倉鼠生存率，Ad-TD-LUC和Ad-TD-IL-12無明顯治療效果，低劑量Ad-TD-IL-12仍導(dǎo)致部分實驗動物比對照組死亡更早。3.5 在敘利亞倉鼠倉鼠胰腺癌SHPC6腹腔播散腫瘤模型中，Ad-TD-LUC能顯著提高荷敘利亞倉鼠生存率，Ad-TD-nsIL-12能治愈所有荷瘤動物，而高中低三個劑量的Ad-TD-IL-12都不能顯著提高荷敘利亞倉鼠生存率。在給予一次大劑量的Ad-TD-

10、nsIL-12也能治愈所有荷瘤動物。
　　4 結(jié)論:Ad-TD-nsIL-12在不同的胰腺癌腫瘤模型中具有很強的抗腫瘤作用和安全性。
　　第三部分 新型溶腫瘤腺病毒的安全性和抗腫瘤機制研究
　　1 目的:檢測Ad-TD-nsIL-12的安全性和抗腫瘤作用機制。
　　2 方法:2.1 采用生化分析儀檢測敘利亞倉鼠胰腺癌腹腔播散模型在腹腔注射溶腫瘤腺病毒后在第1，3，5天外周血中反映肝功能的酶水平和IL-12的表達情

11、況。HE染色檢測敘利亞倉鼠胰腺癌原位模型在腹腔注射溶腫瘤腺病毒后在第1和3天肝臟細胞損傷情況。2.2 將胰腺癌皮下腫瘤模型療效實驗中Ad-TD-IL-12或者Ad-TD-nsIL-12治療組腫瘤全部被清除的實驗動物重新接種原皮下接種的胰腺癌腫瘤細胞HPD1NR和腎癌細胞Hak，其中一組在接種HPD1NR的前一天腹腔注射CD3刪除抗體。在敘利亞倉鼠胰腺癌SHPC6腹腔播散模型治療40天后，在腹腔重新接種SHPC6。2.3 構(gòu)建敘利亞倉鼠倉

12、鼠胰腺癌HPD1NR皮下腫瘤模型，當(dāng)腫瘤體積為300mm3時，腹腔內(nèi)注射對照抗體，CD3和CD4刪除抗體，第二天開始腫瘤內(nèi)注射Ad-TD-nsIL-12進行治療，觀察腫瘤生長情況。2.4 構(gòu)建敘利亞倉鼠倉鼠胰腺癌HPD1NR皮下腫瘤模型，當(dāng)腫瘤體積為300mm3時，腫瘤內(nèi)注射一次新型溶腫瘤腺病毒進行治療，在第3，7，21天分別取動物的脾臟、引流淋巴結(jié)和腫瘤組織，分別進行流式細胞術(shù)、實時熒光定量PCR和免疫組化檢測脾臟、引流淋巴結(jié)和腫瘤組

13、織的免疫細胞群和細胞因子的變化。2.5 構(gòu)建敘利亞倉鼠倉鼠胰腺癌Hap-T1原位腫瘤模型，腹腔內(nèi)注射新型溶腫瘤腺病毒進行治療，在不同時間點分別取動物的肝臟、外周血和腫瘤組織，分別進行ELISA、實時熒光定量PCR和免疫組化檢測IL-12表達、免疫細胞群和病毒蛋白的變化。2.6 將nsIL-12基因插入到溶腫瘤痘苗病毒和腺病毒11載體中，構(gòu)建了VV-nsIL-12和Ad11-nsIL-12。構(gòu)建敘利亞倉鼠胰腺癌SHPC6腹腔播散腫瘤模型，

14、檢測不同劑量下VV-nsIL-12和Ad11-nsIL-12的治療作用。
　　3 結(jié)果:3.1 生化分析顯示Ad-TD-nsIL-12和對照病毒Ad-TD-LUC不引起明顯的肝功能的酶AST、ALT和ALP水平的升高，而Ad-TD-IL-12引起肝功能的酶水平顯著增高;在外周血中Ad-TD-IL-12高表達IL-12，而Ad-TD-nsIL-12持續(xù)表達低水平的IL-12。3.2 當(dāng)胰腺癌皮下腫瘤模型療效實驗中的腫瘤全部被清除的實

15、驗動物重新接種原皮下接種的腫瘤細胞HPD1NR時，不能形成腫瘤;接種的腎癌細胞Hak腫瘤持續(xù)生長;在接種HPD1NR的前一天腹腔注射CD3刪除抗體的動物的腫瘤持續(xù)生長。荷胰腺癌腹腔播散模型的敘利亞倉鼠經(jīng)治療40天后重新接種SHPC6，90％實驗動物未復(fù)發(fā)。3.3 敘利亞倉鼠倉鼠胰腺癌HPD1NR皮下腫瘤模型，在Ad-TD-nsIL-12治療的前一天腹腔內(nèi)注射對照抗體，CD3和CD4刪除抗體。CD4刪除抗體和對照抗體不影響Ad-TD-ns

16、IL-12的抗腫瘤效果，而CD3刪除抗體能抑制Ad-TD-nsIL-12抗腫瘤作用。3.4 在腫瘤組織中，Ad-TD-nsIL-12和Ad-TD-IL-12對腫瘤浸潤T淋巴細胞有相同的影響。在脾臟、引流淋巴結(jié)和腫瘤組織中，Ad-TD-nsIL-12和Ad-TD-IL-12引起促進抗腫瘤作用的相關(guān)細胞因子表達增高。Ad-TD-nsIL-12僅能在第7天使引流淋巴結(jié)的CD4+和CD3+CD4-T細胞增加，不影響脾臟內(nèi)T細胞的增殖，而Ad-T

17、D-IL-12除了能在第7天使引流淋巴結(jié)的CD3+CD4-T細胞增加外，在3，7，21天還影響脾臟內(nèi)CD3+CD4-T細胞的增殖。3.5 腫瘤生長曲線顯示，Ad-TD-nsIL-12能顯著抑制腫瘤生長。實時熒光定量PCR結(jié)果顯示溶腫瘤病毒主要靶向腫瘤細胞。免疫組化顯示病毒在腫瘤組織內(nèi)復(fù)制，并且導(dǎo)致腫瘤浸潤淋巴細胞增加。HE染色顯示Ad-TD-nsIL-12對肝臟無明顯毒性。3.6 敘利亞倉鼠胰腺癌SHPC6腹腔播散腫瘤模型，在經(jīng)過VV-